人細胞毒素相關蛋白A（CagA）檢測試劑盒使用說明

實驗原理
此試劑盒基于酶聯免疫法，采用HRP酶聯物；第一次孵育中，樣本中的抗CagA IgG 抗體與包被的CagA 抗原結合，洗板除去未結合的，再次孵育，二抗（過氧化物酶標記的抗人IgG）與CagA-抗原-抗體復合物結合，再次洗板后，無色的顯色劑（TMB）底物液加入微孔內，與過氧化物酶反應生成了有顏色的復合物，加入硫酸終止顏色反應，酶標儀450nm和405nm處檢測顏色強度，標準品和樣本中的抗CagA IgG 抗體濃度與顏色強度成正比
 
試劑盒組成
足夠用于96人份的試劑
試劑盒貯存于2-8℃
各試劑有效期見試劑瓶標簽
試劑盒一旦開封，在2-8℃下可保存2個月
 

1.        【MTP】包被板，96孔，包被有CagA抗原（重組DNA獲得），未用的板條保存于密封袋內2-8℃下

2.        【CAL】標準品，6瓶，1.5ml/瓶，抗CagA IgG 血清基質，濃度為0;15;30;60;120;240 RU/ml，即用，紅色，疊氮化鈉（＜0.1%）作為防腐劑

3.        【CONJ】酶聯物，1瓶，14ml，HRPO標記的小鼠單抗抗人IgG，TRIS 緩沖液，穩定劑，即用，粉色，新霉素作為防腐劑

4.        【WASH】洗滌緩沖液（濃縮），1瓶，50ml，PBS-吐溫20 ，硫柳汞（＜0.05%）作為防腐劑，使用前，用蒸餾水1:20比例稀釋；若出現不溶解的晶體，則需在37℃下溫育數分鐘；稀釋的洗滌液可在2-8℃下保存30天

5.        【DIL】樣本稀釋液（濃縮，）1瓶，20ml，血清基質，穩定劑，紅色，疊氮化鈉（＜0.1%）作為防腐劑，使用前以稀釋的洗滌液1:20比例稀釋；稀釋的樣本稀釋液2-8℃下可保存30天

6.        【TMB】顯色劑，2瓶，15ml，含檸檬酸-磷酸緩沖液，DMSO和H₂O₂的TMB，即用

7.        【STOP】封閉液，1瓶，14ml，1N的硫酸，即用

8.        【CPA】蓋板

9.        塑料包裝袋

實驗所需材料但試劑盒未提供

1.        帶一次性槍頭的可調的，自動的微量移液器

2.        干燥箱，調節至37±2℃

3.        用于試劑稀釋的刻度容器

4.        抽吸式泵或自動洗板設備

5.        酶標儀（450nm和405nm）

6.        坐標紙

7.        蒸餾水

此實驗還可以用自動酶標儀進行操作
 
樣本采集與準備
試驗可檢測血清或血漿樣本
適量的脂血樣本不會影響結果，高含量的脂血或溶血樣本可能會影響試驗，纖維蛋白絲會干擾試驗；確保檢測前樣本是清澈的，樣本在2-8℃下可保存1周，想要保存更長時間建議凍存于-20℃，避免反復凍融
使用前：以1:300的比例用先前已稀釋的樣本稀釋液進行樣本稀釋
     （如：10 ul 樣本+ 2990 ul的稀釋液）
 
實驗步驟
試劑和樣本平衡至室溫
使用前來回倒置混勻樣本

1.        準備的微孔：空白，標準品和樣本

2.        加100 ul 的標準品和先前稀釋的樣本于相應的微孔內

   注意：標準品不用稀釋

1.        空白孔內加100 ul 的樣本稀釋液

2.        用試劑盒內提供的膠粘紙張蓋住包被板，37±2℃下孵育60±5 min

3.        350 ul的稀釋的洗滌液，洗板4次，吸走微孔內的所有液體

4.        每孔加100 ul的酶聯物

5.        用試劑盒內提供的膠粘紙張蓋住包被板，37±2℃下孵育30±2 min

6.        按照步驟5）洗板

7.        每孔加100 ul的顯色劑

8.        37±2℃下孵育15 min，避免直射陽光

9.        每孔加100 ul的封閉液

10.     采用合適的酶標儀在50nm處讀取吸收值，參考波長620nm（以空白對照孔校零），萬一出現了吸收值溢出，則選擇在405nm處讀數；試驗操作結束15min內必須完成讀數

（若采用的是自動酶標板設備，依據相關手冊操作）
 
實驗操作圖

結果計算
線性坐標紙上以標準品的濃度為X軸，吸收值為Y軸，繪制標準曲線；相應的抗-CagA IgG抗體濃度（RU/mL）根據各樣本吸收值從標準曲線獲得

1.        樣本IgG 值小于10 RU/mL，則判定為抗CagA IgG 抗體無反應

2.        樣本IgG 值10 -15 RU/mL，則判定為弱反應

3.        樣本IgG 值高于15 RU/mL，則判定為抗CagA IgG 抗體有反應

計算示例
以下數值僅供演示示例，不能用于代替實驗數值，通過標準曲線得到樣本抗CagA IgG 抗體滴度為70 RU/mL。
 
驗證標準
結果計算之前，先確保質控吸收值在以下期望值范圍內

若數值不在期望值范圍內，需重新實驗