1. 準備工作，開水浴鍋，預熱試劑，超凈工作臺紫外照射 30min,找到對應細胞在液氮罐中的位置

2. 紫外照射后風機吹 10min 后，酒精擦拭臺面，放入試劑和離心管，取 15ml 離心管，加入 9ml 培養液

3. 在液氮罐中取出細胞，先擰松放液氮，再擰緊，將凍存管放入 PE 手套中，然后水浴融化后取出，1-2min

4. 將凍存管噴酒精后放入超凈臺內，擦干管壁，用 1ml 頭將細胞轉移到已加培養液的離心管中

5. 800-1000rpm 離心 5min,注意配平

6. 將離心好的細胞棄上清，加入 5ml 完全培養基重懸，用移液管吹打 8-10 次， 避免產生氣泡，將細胞懸液接種到 250px 培養皿中，補加 5ml 培養液

7. 混勻，十字法或者 8 字法

8. 將混好的細胞放入培養箱中培養

人結膜上皮細胞。注意事項

1. 上述操作方案的數據可作為參考，實際操作已實驗室配備的耗材為準，

2. 凍存時含 10%DMSO,事先加 9ml 培養液是為了稀釋 DMSO，理論上 1%DMSO

對細胞性

3. 隔著 PE 手套能有效防止水浴過程中導致污染

4. 重懸的體積只是作為參考，具體的根據需要可進行調整

5. 由于復蘇過程中已經離心，第二天可根據實際情況選擇換液或者不換液（主要針對貼壁細胞）

人結膜上皮細胞。培養操作

1）復蘇細胞：將含有 1mL人結膜上皮細胞。懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培 養過夜（或將 細胞懸液加入 250px 皿中，加入約 8ml 培養基，培養過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養。

人結膜上皮細胞。培養注意事項

1. 收到人結膜上皮細胞。后首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，若有上述現 象發生請及 時和我們聯系。
2. 仔細閱讀人結膜上皮細胞。說明書，了解細胞相關信息，如細胞形態、所用培養基、比例、所需細胞因子等，確保細胞培養條件一致。若由于培養條件不一致而導致細胞出現問 題，責任由客戶自行承擔。
3. 用 75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態。因運輸問題貼壁細胞會有少量 從瓶壁脫落，將細胞置于培養箱內靜置培養 4~6 小時,再取出觀察。此時多數細胞均會貼壁，若細胞仍不能貼壁請用臺盼藍 染色測定細胞活力，如果證實細胞活力正常， 請將細胞離心后用新鮮培養基再次貼壁培養；如果染色結果顯示細胞無活 力，請拍下 照片及時和我們聯系，信息確認后我們為您再免費寄送一次。
4.靜置細胞貼壁后，請將細胞瓶內的培養基倒出，留 6~8mL 維持細胞正常培養，待細 胞匯 合度80%左右時正常傳代。
5. 請客戶用相同條件的培養基用于細胞培養。培養瓶內多余的培養基可收集備用，細胞傳代時可以 一定比例和客戶自備的培養基混合，使細胞逐漸適應培養條件。
6.建議客戶收到人結膜上皮細胞。后前 3 天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態，便于和 志偉技術 部 溝通交流。由于運輸的原因，個別敏感細胞會出現不穩定的情況，請及時和我們聯 系，告知細胞的具體情況，以便我們 的技術人員跟蹤回訪直至問題解決。