人胰腺癌裸小鼠模型的建立實驗

實驗方法原理 將人胰腺癌細胞株8988 接種于裸鼠腋窩處皮下，每周測量腫瘤大小，第42d 處死小鼠。腫瘤組織及相關臟器送病理及電鏡檢查，放射免疫法檢測相關抗原。皮下腫瘤組織細胞及細胞株培養，HE 染色。

實驗材料 裸小鼠BALB c nu-nu胰腺癌細胞株8988

試劑、試劑盒 RPMI-1640 完全培養基胰酶戊二醛

儀器、耗材 CO2 培養箱試管

實驗步驟

一、實驗材料準備　

裸小鼠BALB/ c nu- nu ，4～6 周齡，體重16～20 g，雌雄兼備，SPF 級環境中飼養，恒溫25～27 ℃，恒濕45%～50% ，飲用水及食物均經滅菌。

二、人胰腺癌細胞株8988 體外傳代培養

1.  將人胰腺癌細胞株放入含10 %的RPMI-1640 完全培養基中，置于37 ℃、5 %CO2 培養箱中，每2d 換液1次，2～3d，0. 25 %的胰酶消化，一傳3 傳代培養。

2.  待細胞布滿瓶底時,收集單細胞懸液，每只5 ×106 腫瘤細胞，0. 2ml ，注射于裸小鼠腋窩處皮下，建立腫瘤模型。

3.  每周用游標卡尺測量腫瘤大小，按公式V= π/ 6 ×長×寬×高，計算腫瘤大小，并繪制生長曲線。

三、血清學檢測

第6 周時拔眼球法處死小鼠，收集血液于試管中，靜置取血清，檢測腫瘤相關抗原及淀粉酶。

四、巨檢

1.  處死裸鼠后，皮下剝離腫瘤，記錄質地、浸潤、血供情況，觀察有無腹腔粘連，各臟器轉移狀況。

2.  將腫瘤組織、肺、肝、脾、腸系膜、十二指腸、胃、腦等取標本置于10 %的福爾馬林固定液中待用。

五、病理學檢測

上述標本常規石蠟包埋切片，HE 染色，光鏡觀察。

六、超微結構觀察

腫瘤組織2. 5 %戊二醛，1 %鋨酸雙固定，包埋，超薄切片，鈾鉛雙重染色，透射電鏡觀察。

七、鏡檢

1.   腫瘤組織細胞培養及活細胞觀察：取新鮮裸鼠皮下腫瘤組織，PBS 漂洗3 次，剪成1 m3 大小，0. 25 %的胰酶消化，去除粗大組織后，制成單細胞懸液，置37 ℃、5%CO2 培養箱中培養，倒置顯微鏡下觀察其形態、生長情況等， 并與細胞株8988 進行比較。

2.  細胞HE 染色及形態學觀察：腫瘤細胞及細胞株相同量培養于含有蓋玻片的六孔板中， 生長至次融合后，棄培養基，PBS 洗3 次，2. 5 %戊二醛固定，PBS 洗3 次，HE 染色，光鏡下觀察比較。

其他

一、實驗討論

胰腺癌是惡性程度高、發展快、預后極差的腫瘤，早期癥狀不典型，至出現明顯癥狀時，多已進入晚期,失去了根治機會。對傳統的放、化療不敏感,即使是成功地實施了手術的病人，由于術后易轉移，5 年生存率僅接近20 % 。

為了研究胰腺癌的生物學特性，探討其診斷及治療的有效措施，建立動物模型是非常必要的。動物荷瘤模型來源一般有3 種：自發性腫瘤、誘發性腫瘤及移植性腫瘤。由于自發性腫瘤具有不確定性及不穩定性，極少單獨做腫瘤模型用。腫瘤的誘發因素還不是很明確的情況下，誘發性腫瘤的成功率較低，而且所誘發的腫瘤同時存在多種組織學類型，不利于對腫瘤更精細地進行研究，小鼠先天胸腺缺乏，T 細胞不能正常分化，對來自異體的組織沒有排斥作用，廣泛地應用于人類腫瘤的移植，但是裸鼠并不是免疫空白動物，其成年的N K 細胞活性較高，所以皮下種植較原位移植的成功率高。

本實驗采用皮下種植,腫瘤細胞的生物學特性保持完好，腫瘤組織光鏡及電鏡觀察符合細胞株8988 原有的結構特點，形態學未見明顯差異，腫瘤組織細胞培養，其形態學與細胞株8988 基本符合，動物個體間差異小，血清檢測未發現腫瘤相關抗原，考慮皮下種植由于腫瘤包膜完整，局部浸潤，無遠程轉移引起。

一般影響動物實驗結果的因素有種屬、年齡、體重、性別、生長環境等，本實驗采用BALB/ c nu- nu 健康裸小鼠，4～6 周齡，體重控制在16～20 g ，SPF 級環境下飼養，飲用水及食物消毒后由裸鼠自由食用，基本避免了這些因素的影響，裸鼠雌雄兼備，實驗中未見性別對結果有顯著影響。

本研究結果顯示，人胰腺癌細胞株8988 接種后，潛伏期短(5～7 d) ，生長良好，成功率高(95 %)，且方法簡單，易于操作，生物學特性保持較好。而且由于腫瘤生長在皮下，非常容易觀察實驗藥物的療效及腫瘤大小的變化，可用于胰腺癌藥物的療效研究。GOLD David V 等用荷人胰腺癌裸鼠做放射免疫治療實驗，取得了較好的結果。