人血清外泌體癌胚抗原檢測在結直腸癌診斷中的臨床應用

結直腸癌是世界第三高發的惡性腫瘤，近年來我國結直腸癌發病率和死亡率正逐年上升，結直腸癌早期治療效果很好，但由于早期癥狀隱匿，患者確診時大多已發展到中晚期，錯過了最佳治療時期。因此急需尋找一種非侵襲性的、快速、簡便的診斷方法，早期診斷標志物便是一種很好的方法，但當前診斷結直腸癌的血清標志物仍比較匱乏，常用的如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)等。

外泌體(extracellular vesicles，exosomes)是廣泛存在于血細胞、樹突狀細胞、腫瘤細胞等各類細胞中的囊泡樣結構，在生理和病理狀態下均可釋放，由于EVs含有受體、生物活性脂質、蛋白、核酸等，故其可向受體細胞傳遞重要的遺傳信息，是細胞間信號傳遞的重要途徑，近期許多研究已表明，外泌體內包含的許多重要蛋白可以用于腫瘤的早期診斷，本研究通過分離并檢測結直腸癌患者與健康人血清外泌體CEA的濃度，探究血清外泌體CEA用于結直腸癌診斷的可能性。

01

材料和方法

一、材料

1．主要儀器與試劑：

透射電子顯微鏡(PHILIPS公司)，Zetaview可視化納米粒度儀(德國Particlemetrix公司)，酶標儀(Thermo Fisher公司)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測CEA試劑盒購自上海武昊公司。血清CEA檢測采用美國羅氏公司Cobas e601型全自動電化學發光免疫分析儀及原裝試劑。兔抗人HSP70抗體、兔抗人CD63購自美國santacruz公司，羊抗鼠IgG二抗購自美國CellSignaling公司。

2．血清來源：

選擇同濟大學附屬同濟醫院胃腸外科2015年10月至2016年12月確診結直腸癌病例血清標本64例，其中男38例，女26例，年齡39～85歲，平均年齡(59±13)歲，其中分為血清CEA正常病例組41例(經電化學發光法檢測血清CEA濃度值在正常參考范圍內)及血清CEA增高病例組23例。選擇同期良性結直腸疾病患者血清標本20例作為良性疾病對照組，其中男9例，女11例，年齡34 ～78歲，平均年齡(57±11)歲。選同期40例同濟醫院健康體檢者作為正常對照組，其中男18名，女22名，年齡19～70歲，平均年齡(48±14)歲，年齡和性別與病例研究對象相匹配。結直腸癌患者診斷標準及分期、分型標準均依據美國腫瘤聯合會第八版癌癥分期系統[5]，見表1。所有入組患者均空腹采集靜脈血5 ml，室溫靜置30 min后3 000×g離心15min, 分離血清，－80 ℃冷凍保存。本研究經過同濟大學附屬同濟醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書[(同)倫審-KYSB-2015-(10)]。

表1 結直腸癌病例組臨床分期情況(例數)

二、方法

1．血清外泌體提取：

血清標本取出室溫復溶后，3 000×g離心15 min，去除殘留細胞及細胞碎片，吸上清液250 μl至新管，加入ExoQuick試劑63 μl，充分混勻，室溫靜置30 min，1 500×g離心30min，棄上清，再次1 500×g離心5 min，棄盡上清，所得沉淀即為外泌體外泌體。

2．透射電鏡下觀察外泌體：

將離心所得的外泌體沉淀物用100 μl的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline，PBS)重懸，取20 μl重懸液載樣于銅網上，室溫靜置2 min，用濾紙從濾網側面小心吸干液體，滴加3%的磷鎢酸溶液20 μl，室溫下復染3min，用濾紙從濾網側面小心吸干復染液，雙蒸餾水洗滌銅網5次，室溫自然干燥后，透射電子顯微鏡下觀察及拍照。

3．Zetaview可視化納米粒度儀鑒定血清外泌體：

將所得的外泌體沉淀物用100 μl PBS重懸，充分混勻后，將所得樣品用PBS進行1∶50 000稀釋，并充分混勻，取混勻后樣品300 μl上機，用Zetaview可視化納米粒度儀進行粒徑和濃度分析。

4．WesternBlot檢測：

采用BCA法對外泌體蛋白定量，根據定量結果調整蛋白濃度，分別取外泌體沉淀物和去除外泌體的血清樣品各20 μg，進行Western Blot檢測。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳(Sodiumdodecyl sulfate-Polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，將蛋白質電轉印(4 ℃，250 mA，60 min)至PVDF，室溫封閉1 h，分別加入兔抗人CD63和HSP70單克隆抗體(1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，次日用1×TBST洗膜，與辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000稀釋)室溫反應60 min，洗膜，利用ECL化學發光劑(CST公司)顯影，壓片。

5．ELISA法檢測血清及外泌體CEA濃度：

去除殘留細胞及細胞碎片的血清樣本用1×PBS 500倍稀釋，外泌體沉淀用100 ml RIPA裂解液在冰上裂解半小時，充分振蕩混勻，用1×PBS 3倍稀釋。在CEA抗體包被的微孔板分別加標準品，空白對照，各組稀釋后的血清及外泌體樣品各100 μl，37 ℃孵育60 min，甩掉微孔板中液體，拍干，加入A液，37 ℃孵育60 min，洗板3次，加入B液37 ℃孵育30 min，洗板5次，加90 μl底物，37 ℃避光孵育15 min，再加50μl終止液，立即在450 nm波長測定。

6．統計學方法：

采用SPSS 19.0統計軟件包進行統計分析，經K-S檢驗，各組數據呈偏態分布，計量資料采用最小值-最大值(中位數)的形式表示，組間兩兩比較用Mann-Whitney U檢驗。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線評價各指標對結直腸癌的診斷效能，各指標曲線下面積比較用Z檢驗，以P<0. 05作為差異有統計學意義。

02

結果

一、血清外泌體

使用ExoQuick試劑盒對人血清外泌體提取，所有血清樣本均提取到淡黃色脂樣沉淀，即外泌體沉淀外泌體。

二、血清外泌體的形態特征

1．形態學鑒定：

透射電鏡下觀察，外泌體提取物均呈圓形或類圓形的小囊泡，直徑約40～100 nm，包膜完整，背景清晰，未見細胞碎片，如圖1。

圖1人血清外泌體透射電鏡觀察圖，箭頭所示為外泌體(×46 000倍)

2．Zetaview可視化納米粒度儀鑒定血清外泌體：

利用Zetaview可視化納米粒度儀對外泌體懸液內的粒子進行動態檢測，結果提示，健康體檢者血清外泌體的直徑主要集中在40～150 nm，最大分布峰值為95.1nm，占比97.5%，濃度為3.9×1012個/ml，結直腸癌患者血清外泌體的直徑主要集中在40～160 nm，最大分布峰值為99.5 nm，占比98.4%，濃度為3.3×1012個/ml，如圖2。

圖2 正常對照組(A圖)　與結直腸癌病例組(B圖)　血清外泌體的Zetaview可視化納米粒度儀粒徑分布

3．Westernblot檢測外泌體表面標記蛋白CD63、HSP70：

血清外泌體樣本中可見明顯的外泌體標志物CD63和HSP70的表達條帶，而去除外泌體的血清上清液中二者均未能檢測到，如圖3。

圖3 Western bolt檢測外泌體表面標記蛋白

三、ELISA法檢測結直腸癌病例組、良性疾病對照組與正常對照組血清外泌體CEA濃度情況

ELISA法檢測證實人血清外泌體中存在CEA。64例結直腸癌病例組外泌體CEA濃度為(1 056.36～28637.78)pg/ml，明顯高于良性疾病對照組(394.61～2 437.83)pg/ml以及正常對照組(610.89～2 076.70)pg/ml，差異有統計學意義(分別U＝124.000，U＝119.000；均P<0.001)；結直腸癌病例組外泌體CEA與血清CEA正常病例組(1056.36～5 832.07)相比，差異有統計學意義(U＝1 002.000，P＝0.042)；血清CEA增高病例組(2 379.32～28637.78)與良性疾病對照組、血清CAE正常病例組及正常對照組相比，差異均有統計學意義(分別U＝68.000，U＝72.000，U＝62.000，均P<0.001)；血清CEA正常病例組外泌體CEA與良性疾病對照組和正常對照組相比，差異有統計學意義(U＝113.000，U＝119.000；均P<0.001)，見表2。

表2 各組間CEA結果比較(pg/ml)

四、ELISA法檢測結直腸癌病例組、良性疾病對照組與正常對照組血清CEA濃度情況

ELISA法檢測41例CEA正常病例組血清CEA濃度為(15 298.01～75938.02)pg/ml，與良性結直腸疾病患者血清CEA濃度(31144.97～58 632.76)pg/ml比較差異無統計學意義(U＝405.000，P>0.05)，與健康對照組血清中CEA濃度(9 688.32～57950.80)pg/ml比較差異也無統計學意義(U＝664.000，P>0.05)；血清CEA增高病例組(26 704.16～578 230.74)與良性疾病對照組、血清CAE正常病例組及正常對照組相比，差異均有統計學意義(分別U＝56.000，U＝34.000，U＝48.000，均P<0.001)，見表3。

表3 各指標對診斷結直腸癌的效能比較

五、血清外泌體CEA對結直腸癌輔助診斷價值

圖4利用ROC曲線分析外泌體CEA濃度對結直腸癌的輔助診斷效能，結果顯示，血清外泌體CEA對結直腸癌診斷的ROC曲線下面積為0.954(95% CI＝0.919～0.988)，血清CEA對結直腸癌診斷的ROC曲線下面積為0.636(95% CI＝0.531～0.742)，二者相比有統計學意義(Z＝5.58，P<0.01)，說明血清外泌體CEA對結直腸癌的診斷效能優于血清CEA，當血清外泌體CEA的cut-off值為1648.51 pg/ml時，診斷效能最佳，此時其診斷結直腸癌的敏感度為84.4%，特異度為97.5%，表明檢測外泌體CEA濃度是診斷腸癌的一項良好指標(表3)。

圖4 外泌體CEA對結直腸癌的診斷效能

03

討論

目前，外泌體分離及純化方法國際上尚無統一標準，各種方法間提純的產量、純度及顆粒性狀的差異較大，都存在技術上的制約，目前對外周血中外泌體常用的分離方法主要有超高速差速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、聚合沉淀法、免疫分離法、微流控技術和色譜法等[6,7]，其中超高速差速離心法是金標準，但耗時、回收率低，尤其對血漿或血清這類黏性生物體液的分離效率較低，我們選用了快速簡便的ExoQuick試劑盒來分離人血清樣本中的外泌體，并用于后續研究。

圖1顯示透射電鏡下觀察，外泌體呈圓形或橢圓形，包膜完整，背景清晰。Zetaview可視化納米粒度儀檢測結直腸癌患者外泌體直徑主要集中在40～160 nm，最大分布峰值為99.5nm，占比98.4%，濃度為3.3×1012個/ml，高于文獻報道[8,9,10]。雖然外泌體所含成分根據細胞及組織來源不同而有差異，但所有的外泌體都包含膜轉運蛋白和膜融合蛋白(GTPases、Annexins和Flotillin等)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90等)、四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82等)、參與多囊泡體生物合成的蛋白質(Alix和TSG101等) 以及脂質相關蛋白等[11]。本研究選用熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)和四跨膜蛋白CD63作為血清外泌體的鑒定指標，我們通過western Blot檢測到了外泌體中這兩種蛋白質的存在，同時也印證了ExoQuick試劑盒抽提血清外泌體方法的可行性。

大量研究表明，外泌體參與腫瘤的發生、發展及轉移，由于外泌體所含蛋白質或核酸等內含物可有效反應來源細胞的真實特征和狀態，所以外泌體可能為腫瘤提供可靠的早期診斷標志物及特異性治療靶點[12,13,14,15]，癌胚抗原CEA作為腫瘤標志物常被用于結直腸癌的篩查，但研究發現，術前血清CEA升高的患者在接受治療時常已發生微小轉移灶，所以血清CEA水平升高可能預示結直腸癌患者治療后復發或轉移的發生，對腫瘤早期診斷并不敏感。為了探尋結直腸癌診斷更好的標志物，本研究分離結直腸癌患者血清外泌體，用ELISA法檢測到外泌體CEA濃度，證實人血清外泌體中存在CEA蛋白，為進一步研究探討外泌體CEA在結直腸癌診斷中的應用價值，我們通過ELISA法分別檢測結直腸癌病例組、同期良性疾病對照組及正常對照組血清及外泌體CEA濃度。表3中結果顯示，結直腸癌病例組外泌體CEA濃度明顯高于良性疾病對照組及正常對照組，且血清CEA正常病例組外泌體CEA濃度也明顯高于良性疾病對照組及正常對照組，而血清中CEA濃度在血清CEA正常病例組與良性疾病對照組及正常對照組間卻無顯著差異，提示血清外泌體CEA檢測可增加結直腸癌患者臨床診斷的敏感性。ROC曲線分析發現，血清外泌體CEA濃度對結直腸癌診斷的ROC曲線下面積為0.954(95% CI＝0.919～0.988)，血清CEA的曲線下面積為0.636，明顯低于外泌體CEA(Z＝5.58，P<0.01)，提示與血清CEA檢測相比，血清外泌體CEA對結直腸癌的診斷效能更優，但由于CEA是一個特異性較差的腫瘤標志物，在其他空腔臟器腫瘤中也會升高，如胃癌、肺癌等[16]，因此，在結直腸癌的診斷中應排除有無其他腫瘤或疾病的影響。