人非小細胞肺癌裸鼠原位種植轉移模型的建立實驗

將表達GFP的質粒pRNAT-U6/Neo轉染人肺腺癌細胞A549，G418篩選獲得穩定表達GFP細胞，對比轉染前后細胞的生長活性和成瘤性。將轉染后細胞原位種植裸鼠預定標準處死。HE染色和免疫組化檢測轉移灶的位置和數目。利用KODAK  IS2000MM系統檢測腫瘤播散情況。

BALB c nu nu裸鼠腺癌細胞株A549

小牛血清RPMI-1640培養液pRNAT-U6 Neo磷酸鈣即用型SP超敏 感免疫組化染色試劑盒DAB Kit 顯色試劑盒甲醛EDTA戊巴比妥鈉

熒光顯微鏡光學顯微鏡

一、實驗材料準備

1.  BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周齡，體重18-20 g，無特定病原體(SPF)級飼養。

2.  肺腺癌細胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基(美國Gibcobrl公司)，5% CO₂37℃培養，常規傳代。
 

3.  質粒和篩選藥物質粒pRNAT-U6/Neo(美國Genscript公司)，攜帶Neomycin耐藥基因供篩選，在CMV啟動子控制下編碼cGFP作為轉染標記物。G418(美國Promega公司)800 μg/ml初篩后200 ug/ml維持篩選。

二、細胞的轉染

1.   哺乳動物磷酸鈣轉染系統(美國Promega公司)，按照操作指南將質粒pRNAT-U6/Neoo轉入A549細胞，轉染后24~48 h熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

2.  后培養液內加G418篩選獲得穩定轉染。

3.  利用平板克隆形成試驗測定細胞克隆形成率>10%后，有限稀釋法獲得表達GFP陽性細胞。

4.  1月后收獲轉染細胞，常規傳代培養，培養液中加G418(200 ug/ml)維持篩選。

5.  測定轉染后A549細胞增殖動力學指標，對比轉染前后A549細胞生長曲線，檢測轉染后細胞的生長活性是否受轉染的影響。

6.  待細胞增殖達一定數量后，裸鼠皮下注射轉染前后細胞，記錄成瘤時間，用公式V=1/2x長x寬 計算腫瘤體積，對比轉染前后兩組裸鼠的瘤體大小以檢測成瘤性是否有差別。

三、人肺腺癌A549裸鼠原位種植模型的建立
 

1.  取轉染后細胞，用不含血清的RMPI 1640培養液沖洗2次并調整細胞最終濃度為5x10⁶/0.2 ml備用。

2.  用0.5%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)(中國醫藥上海化學試劑公司)腹腔注射麻醉裸鼠，用26號針頭吸取細胞懸液0.2 ml注射入裸鼠左側胸腔，注射過程中注意控制刺入針頭的深度。

3.  整個操作過程在細胞收獲后半小時內完成，嚴格遵循無菌原則。

4.  注射后在KODAK IS2000MM下確認原位種植成功，注射部位為胸腔。

5.  注射后繼續飼養，隔天觀察一次并記錄體重。

6.  當裸鼠出現精神萎靡、呼吸短促、弓背并明顯消瘦，體重較注射Et減輕20%時，頸椎脫位術處死裸鼠。

7.  開胸觀察，取出器官，用10%甲醛固定保存。
 

四、檢查項目
 

1.  轉染后細胞熒光顯微鏡成像轉染后24～48 h熒光顯微鏡下觀察，確認轉染成功。單克隆化過程中鏡下觀察細胞克隆生長情況。
 

2.  活體GFP標記成像檢測應用KODAK IS2000MM進行活體熒光成像，確認注射部位為胸腔，后間斷應用以活體確認瘤細胞的遠處轉移。
 

3.  解剖學與組織學檢查處死的裸鼠均經

詳細解剖學檢查，取出器官、固定包埋后，以4 tun厚度連續切片，切片嚴格編號，奇數號行HE染色，光鏡觀察，以初步確定轉移灶。
 

4.  免疫組織化學染色
 

選擇肺臟、肝臟和腦作為主要研究器官，在HE染色確定轉移灶位置的基礎上，取相鄰偶數號碼的切片進行免疫組化檢測，CEA鼠抗人單克隆抗體(ZM-0062)，LRP鼠抗人單克隆抗體(ZM．0335)工作液，即用型SP超敏感免疫組化染色試劑盒(sP-9000)、抗原修復液、DAB Kit顯色試劑盒(zU一9032)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
 

五、統計學處理

細胞的生長活性和腫瘤體積x ± s表示，數值的比較采用方差分析。HE檢測結果和活體成像檢測結果的比較用x²檢驗。采用SPSSl3．0軟件進行統計分析。

原位種植時應遵循嚴格的生物安全標準，避免細菌污染。

原位種植法模擬肺癌發生的自然環境，是建立肺癌轉移模型的最佳方法。腫瘤學研究中應用最多的皮下種植法建立的模型只是局部包塊而無遠處器官的轉移和播散，不出現腫瘤相關癥狀。胸腔內原位種植法操作簡便，重現臨床NSCLC轉移過程；GFP轉入人肺腺癌A549細胞對生長活性和致瘤性無影響，A549/GFP用于NSCLC轉移模型結果可靠；借助于熒光顯像設備，利用GFP的示蹤功能可以非侵人性檢測NSCLC轉移。