一般根據支原體種類不同，采取不同的方法進行檢測。目前常用的檢測方法有：
1. 試劑盒檢測法：
目前已有專門做支原體檢測的試劑盒，可以用細胞滴片進行檢測。
2. 觀察細胞的形態和生長特征：
支原體污染比較嚴重時可出現生長減慢，有的培養基pH明顯變酸，并出現細胞病變，以此可依次對支原體污染進行檢測，但有些情況下支原體污染引起的病變特征與病毒感染相似，因此不能準確診斷。
3. 分離培養法：
大多數支原體可出現特有的典型菌落。因而可依次盡心檢測，該方法準確、可靠，但時間長，敏感性不夠高。
4. DNA結合熒光素染色法：
利用熒光染劑（bisbenzimide,Hoechst 33258）偵測支原體污染。熒光染料會結合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區域，因為支原體DNA中A-T含量占多數（55～80%），所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細胞經染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之熒光小點，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。
5. 電子顯微鏡和免疫電子顯微鏡法：電子顯微鏡或者免疫電鏡下對樣本進行觀察，此法較準確，但受條件限制，時間長，敏感性不高。
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6. 間接免疫熒光法和免疫印跡：簡便、快速、特異性強。