不對稱 PCR 的基本原理是采用不等量的一對引物,經若干次循環后,低濃度的引物被消耗盡,以后的循環只產生高濃度引物的延伸產物,結果產生大量的單鏈 DNA(ssDNA)。這兩種引物分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是1/50～1/100,因為 PCR 反應中使用的兩種引物的濃度不同,因此稱為不對稱PCR。
不對稱 PCR 主要為測序制備 ssDNA,其優點是不必在測序之前除去剩余引物,因為量很少的限制性引物已經耗盡。多數學者認為,用 cDNA 經不對稱 PCR 進行 DNA 序列分析是研究真核 DNA 外顯子的好方法。