雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。
切口平移法(nick translation) 利用微量的DNA酶Ⅰ使待標記的雙鏈DNA分子產生若干切口，然后利用DNA聚合酶Ⅰ的5'→3'外切酶活性從從切口的5'端除去核苷酸；同時DNA聚合酶Ⅰ還有5'→3'的聚合酶活性可將反應體系中的核苷酸底物連接到切口的3'羥基末端。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,此時若反應體系中含有標記的核苷酸，它們就會摻入到新合成的鏈中，獲得帶有標記的DNA探針。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。
切口平移反應受幾種因素的影響:
(1)探針的大小及比活與DNA酶Ⅰ的用量直接相關，酶量過多會造成切口過多,探針長度下降而且還會引起新合成的標記鏈被切開。所以，DNA酶Ⅰ的用量不宜過多。
(2) 通常標記0.5~1gDNA樣品只需加入20~100pg的DNA酶Ⅰ。
(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 降低標記效率，故應使用仔細純化后的DNA。