從包涵體中純化表達蛋白

表達靶蛋白的大腸桿菌細胞

細胞裂解緩沖液 I 細胞裂解緩沖液Ⅱ 脫氧膽酸 濃鹽酸 包涵體溶解緩沖液 I 包涵體溶解緩沖液Ⅱ KOH PMSF SDS 凝膠加樣緩沖液 含尿素的 Tris-Cl DNaseI 溶菌酶 SDS-聚丙烯酰胺凝膠

Sorvall GSA 轉頭或相當的轉頭 pH 試紙 磨光玻璃棒

材料

緩沖液和溶液

貯存液、緩沖液和試劑的成分請參見附錄 1。
貯存液稀釋至適當濃度。

細胞裂解緩沖液 I
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
1mmol/LEDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl

細胞裂解緩沖液Ⅱ, 冰冷
50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
10 mmol/L EDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl
0.5% TritonX-100

脫氧膽酸
使用蛋白級的膽酸/去污劑。

HCl(12mol/L)(濃鹽酸）

包涵體溶解緩沖液 I
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
100 mmol/LNaCl
8mol/L 尿素
0.1mol/LPMSF
緩沖液現用現配。

包涵體溶解緩沖液Ⅱ
50 mmol/LKH₂PO₄(pH10.7)
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
50 mmol/LNaCl

KOH(10mol/L)

PMSF(100 mmol/L)

1x 和 2XSDS 凝膠加樣緩沖液
不含 DTT 的 1x 和 2xSDS 凝膠加樣緩沖液室溫保存，lmol/LDTT 貯存液現用現加于上述緩沖液。

含尿素的 Tris-Cl(0.1mol/L,pH8.5)
僅限于方法 2 使用，請見步驟 7。配制內含尿素濃度遞增（如 0.5、1、2 和5mol/L) 的 0.1mol/L Tris-Cl(PH8.5)。使用前用固體尿素現用現配，不能使用任何尿素貯存液，因為尿素容易分解。

酶和緩沖液

DNaseI(1 mg/ml)

溶菌酶（10 mg/ml)
用 Tris-Cl(PH8.0) 現用現配。

凝膠

SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%)
用于分離蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的制備請參考附錄 8。

離心機和轉頭

Sorvall GSA 轉頭或相當的轉頭

特別配備

pH 試紙
備用，請見步驟 10。

磨光玻璃棒

載體和細菌菌株

表達靶蛋白的大腸桿菌細胞
培養 1L 以包涵體形式表達靶蛋白的大腸桿菌細胞

方法

制備細胞抽提物

1.1L 表達細胞培養物于預先稱重的離心管中 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 轉頭）離心 15 min。
注意：步驟 2~4—定要在 4°C 進行。

2. 吸去上清，稱菌體沉淀的重量，每克（濕重）菌體加入 3 ml 細胞裂解緩沖液 I，輕輕旋動或用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。

3. 每克（濕重）菌體加入 4ul 100 mmol/LPMSF,80ul 10 mg/ml 溶菌酶，攪動 20 min 也可以加入其他蛋白酶抑制劑混和物（見方案 1)。

4. 每克（濕重）菌體加入 4 mg 脫氧膽酸，繼續攪動。

5. 懸液 37°C 放置，不時用磨光玻璃棒攪動，待其變黏時每克（濕重）菌體加入 20ul 1 mg/ml DNaseI。

6. 裂解液室溫放置，直至不再黏稠（約 30 min)。

純化和洗滌包涵體

7. 用下述兩種方法之一純化和洗滌包涵體。

方法 1: 用 Triton X-100 提取包涵體

下述流程是對 Marston 等（1984) 所用方法的改進。

a. 細胞裂解物 4°C 高速離心 15 min。

b. 傾倒去除上清，沉淀重懸于 9 倍體積的 4°C 細胞裂解緩沖液Ⅱ。

c. 懸液室溫放置 5 min。

d. 高速離心 15 min。

e. 傾倒上清，留置待用。沉淀重懸于 100ul 水。

f. 各取 10ul 上清和沉淀，分別與 10ul 2XSDS 凝膠加樣緩沖液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析靶蛋白的分布。

g. 必要時繼續步驟 8 溶解包涵體。

方法 2: 用尿素提取包涵體

下面的程序是用含有不同濃度尿素的緩沖液洗滌和溶解包涵體，摘自 Schoner 等 (1985)。

a. 細胞裂解物 4°C 高速離心 15 min。
注意：步驟 b、d 和 f 必須在 4°C 進行。

b. 傾倒去除上清，每克（濕重）菌體沉淀重懸于 1 ml 水中。每支 100ul 裝 4 支離心管，其余 4°C 保存。

c.4°C 高速離心 15 min。

d. 毎份沉淀重懸于 100ul 含不同濃度（如 0.5、1、2 和 5mol/L) 尿素的 0.1mol/L Tris-Cl(pH8.5)。

e.4°C 高速離心 15 min。

f. 傾倒上清，留置待用，每份菌體沉淀重懸于 100ul 水中。

g，各取 10ul 上清和沉淀，分別與 10ul 2XSDS 凝膠加樣緩沖液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析哪個濃度的尿素洗滌效果最佳。

h. 用步驟 g 確定的最佳濃度，按上述方案洗滌剩余包涵體沉淀（步驟 b)。

i. 必要時繼續步驟 8 溶解包涵體。

溶解包涵體

8. 取適量步驟 7 的重懸細胞沉淀，4°C 高速離心 15 min, 沉淀重懸于 100ul 含 0.1 mmol/LPMSF(現用現加）的包涵體溶解緩沖液 I。

9. 室溫放置 lh。

10. 把溶液加入到 9 倍體積的包涵體溶解緩沖液 II 中，室溫放置 30 min。檢査 pH 是否維持在 10.7, 必要時用 10mol/LKOH 調節。

11. 用 12mol/L 鹽酸將溶液 pH 調至 8.0, 室溫放置至少 30 min。

12. 室溫高速離心 15 min。

13. 傾倒上清，留置待用，沉淀重懸于 100ul 1XSDS 凝膠加樣緩沖液。

14. 取 10ul 上清與 10ul 2xSDS 凝膠加樣緩沖液混和，上清和沉淀分別進行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析溶解程度，繼續附加方案。

包涵體復性注意事項

1. 最適 pH 值范圍為 8.0-9.0 之間；

2. 溫度適宜選擇 4℃；

3. 復性過程蛋白濃度不宜過大，一般為0.1-0.2mg/mL；

4. 復性時間一般為 24-36 小時；

5. 低分子化合物 如 L-Arg 有助于增加復性中間產物的溶解度；脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進劑，都可阻止蛋白聚集；Tris 對蛋白質復性有促進作用；EDTA 可以防止蛋白降解；

6. 首先要獲得較高純度的包涵體；

7. 包涵體溶解要徹底，一般應使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施；

8. 透析前后均要離心；

9. 包含體要徹底洗滌干凈，洗滌液中加入適量 Triton-X100；

10. 包含體溶解后裝入透析袋在復性液中復性；

11. 復性完畢在低濃度的緩沖液中連續緩慢透析12-24h ；

12. 復性率的測定時要據變性蛋白和非變性蛋白的光學性質不同測定

13. TritionX100、SDS 這一類去垢劑最后不易去除，在制藥行業中一般不允許采用。用 Triton 洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步，改變培養條件，再洗滌包涵體，有時可以在上柱前已經只剩下 3-4 條雜帶，這樣后續的純化就很方便了。

14. 復性時的蛋白濃度一般為 0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩定，很容易變性。

一、附加方案，請參考

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二、蛋白質重折疊方法，請參考

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三、包涵體復性常見問題分析

1. 包涵體復性原則

低濃度，平緩梯度，低溫。4 n( O5 ~0 q8 D;

2. 怎樣洗滌包涵體？

通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，可以先把包涵體用 6M 鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到 4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，可以找到一個合適去除雜質的辦法，其實這就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脫效果好。

3. 對于尿素和鹽酸胍該怎么選擇

尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素 8-10M，鹽酸胍 6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為 70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質復性后除去不會造成大量蛋白質沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優點，故目前已被廣泛采用。

鹽酸胍溶解能力達 95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產生沉淀、復性后除去可能造成大量蛋白質沉淀和對蛋白質離子交換色譜有干擾等缺點。

4. 8M 尿素溶解的包涵體溶液應如何保存?

在 4 度放置半個月，都沒什么問題 。在室溫放置超過 48 小時，可能會對目的蛋白有影響，因為尿素在堿性條件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些處理 BI 溶液比較好。

5. 復性時的蛋白濃度是？

一般使用濃度為 0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩定，很容易變性。

6. 蛋白復性后濃度低

蛋白可能是在復性的過程中發生降解了。可以將復性好的蛋白濃縮一下跑膠看看。復性過程一般都是低濃度蛋白，需要保證分子間有足夠的折疊空間。一些未正確折疊的蛋白就存在于沉淀中，可能沉淀看不出來，復性后的蛋白高速離心看看。

7. 復性中蛋白析出是怎么回事？該怎么處理？

出現蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復性應該采取復性液濃度和 PH 值逐漸變化的方法，例如根據包涵體的溶液成分，每隔 1 個 PH 或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質能夠正確折疊。但是復性的比率應該很低。若加變性劑尿素可加到 2M，鹽酸胍可加到 1-1.5M；另外可將甘油濃度增加，范圍可在≤30%，且在復性樣品中也可加適量甘油。

8. 復性效果的檢測

根據具體的蛋白性質和需要，可以從生化、免疫、物理性質等方面對蛋白質的復性效率進行檢測。

(1)凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態的蛋白質，或用非還原的聚丙

烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。

(2)光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態下的光譜學特征進行復性情況的檢測，但一般只用于復性研究中的過程檢測。

(3)色譜方法：如 IEX、RP-HPLC、CE 等，由于兩種狀態的蛋白色譜行為不同，

(4)生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。

(5)黏度和濁度測定：復性后的蛋白溶解度增加，變性狀態時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。

(6)免疫學方法：如 ELISA、WESTERN 等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質的折疊狀態。

本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾。