實驗概要
本實驗從外周血淋巴細胞(PBls)中分離得到RNA樣品。
主要試劑
1. Ficoll(Amersham Biosciences)
2. 冰冷磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH 7.4
3. 裂解緩沖液：5mol/L單巰基氰酸胍，10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，50mmol/L Tris—HCl，1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，用0.45微孔濾膜過濾
4. 4mol/L和3mol/L氯化鋰，高壓滅菌
5. RNA溶解緩沖液：0．1%SDS，lmmol/L EDTA，10mmol/LTris—HCl，pH 7．5，高壓滅菌
6. 3mol/L乙酸鈉，pH 4．8，焦碳酸二乙酯 (DEPC) 處理 (加0．2ml DEPC/100ml溶液)并滅菌
7. DEPC處理過的水 (0．2ml DEPC/100ml水)，高壓滅菌
8. 用Tris平衡的酚(Sigma)
9. 氯仿；異戊醇(24：1)(Sigma)
10. 100%乙醇，-20℃
主要設備
1. 30m1Corex管，酸洗并硅化
2. 預冷離心機和吊桶式轉頭
實驗步驟
1．收集新鮮人血液并立即用Ficoll分離白細胞。
2．用冰冷PBS洗滌外周血淋巴細胞3次。
3．在50ml塑料離心管中收集外周血淋巴細胞，并加入7ml裂解緩沖液(可溶解達到5×108個外周血淋巴細胞)，然后劇烈渦旋振蕩以溶解細胞。
4．加入7體積(49m1)4mol/L氯化鋰，4℃孵育15～20小時(過夜)。
5．將懸液轉移到30mlCorex管內，在吊桶式轉頭內4℃離心2小時，6500r/min。
6．棄去上清，并用Kimwipe擦拭試管口。用3mol/L氯化鋰(大約15ml)重懸，收集沉淀.將沉淀重懸液離心，6500r/min 1小時。
7．棄去上清，用2m1RNA溶解液溶解沉淀。在-20℃下，徹底冷凍懸液。
8．復溶懸液，每10分鐘渦旋20秒，共45分鐘。
9．用等體積酚抽提1次，并用等體積氯仿抽提1次。
10．加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉，pH 4.8和2體積一20℃乙醇。徹底混合溶液，并在-20℃下孵育過夜。
11．在吊桶式轉頭內離心RNA，12000r/min 30分鐘。用0.2m1DEPC處理水重懸沉淀。將溶解的DNA轉移至1.5m1微量離心管內，并加入1/10體積3mol/L乙酸鈉，pH 4.8和2體積-20℃乙醇，重新沉淀。并以乙醇沉淀物形式保存RNA，直至準備使用時。