一、分離驅動蛋白
1. 以每克組織 1.5 ml PME 緩沖液的比例進行組織勻漿，勻漿物在 39000 g 離心 30 分鐘。
PME 緩沖液：
0.1 mol/L PIPES，pH 6.9
2 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgSO4
1 mmol/L DTT ( 或 DTE )
0.1 mmol/L GTP
2. 轉移上清并在 100000 g 離心 1 小時。
3. 轉移上清，加紫杉醇至 20 μmol/L，根據所研究組織的特征上升到一定溫度培養 15~30 分鐘。
4. 39000 g 離心 30 分鐘收集微管。
5. 轉移上清，加入三磷酸腺苷雙磷酸酶使濃度為 2 單位/ml，在 25℃ 孵育 30 分鐘。
6. 從冰箱拿出一份不含微管相關蛋白的紫杉醇穩定的微管，加到二磷酸腺苷雙磷酸酶處理的上清中，使終濃度為 0.1 mg/ml。所加微管可以是通過用鹽抽提紫杉醇穩定的微管或通過紫杉醇誘導用磷酸纖維素純化的微管蛋白二聚體進行組裝時制備的。
7. 加 5'-腺苷酰亞氨基二磷酸（AMP-PNP ) 使濃度為 0.5 mmol/L。根據所研究組織的特征，上升到一定溫度培養 30 分鐘。
8. 以 39000 g 離心 30 分鐘沉淀微管和與其結合的驅動蛋白。
9. 去上清，用含 0.1 mmol/L AMP-PNP 和 20 μmol/L 紫杉醇的 PME 緩沖液重懸沉淀物。
10. 以 39000 g 離心 30 分鐘收集微管和與其結合的驅動蛋白。
11. 去掉上清。用少量含 20 μmol/L 紫杉醇和 10 mmol/L Mg-ATP 的 PME 重懸沉淀物。根據所研究組織的特性，上升到一定溫度培養 30 分鐘。在溫育期間，不經常地用巴斯德吸管上下吸溶液來輕輕攪拌。
12. 如步驟 10 離心，分離這時已經從微管釋放出來的驅動蛋白。
二、分離細胞質動力蛋白
1. 以每克組織 1.5 ml PME 緩沖液的比例進行組織勻漿，勻漿物在 39000 g 離心 30 分鐘。
PME 緩沖液：
0.1 mol/L PIPES，pH 6.9
2 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgSO4
1 mmol/L DTT ( 或 DTE)
1.0 mmol/L GTP
2. 轉移上清并在 100000 g 離心 1 小時。
3. 轉移上清并加入二磷酸腺苷雙磷酸酶使濃度為 2 單位/ml，在 25℃ 溫育 30 分鐘。
4. 在步驟 3 溫育的時候，從冰箱拿出一份不含微管相關蛋白的紫杉醇穩定的微管，加到步驟 3 二磷酸腺苷雙磷酸酶處理的上清中，使終濃度為 0.1 mg/ml。微管可以是通過鹽抽提用紫杉醇穩定的微管或通過用紫杉醇誘導組裝磷酸纖維素純化的微管蛋白二聚體而制備的。調整紫杉醇至 20 μmol/L，根據所研究組織的特性，上升到一定溫度培養 30 分鐘。
5. 以 39000 g 離心 30 分鐘收集微管和與其結合的動力蛋白。
6. 去掉上清，用含 20 μmol/L 紫杉醇的 PME 重懸沉淀物，并如步驟 5 收集微管。
7. 去掉上清。用少量含 20 μmol/L 紫杉醇和 10 mmol/L Mg-ATP 的 PME 重懸沉淀物并根據所研究組織的特性，上升到一定溫度培養 30 分鐘。在溫育期間，不經常地通過巴斯德吸管上下吸溶液來輕輕攪拌。
8. 如步驟 5 離心，分離這時已經從微管中釋放出來的動力蛋白。
三、通過蔗糖梯度離心分離驅動蛋白和動力蛋白
1. 用含 0.1 mmol/L GTP 和 1 mmol/L ATP 的 PME 緩沖液準備 5%~20% 的蔗糖梯度。
PME 緩沖液：
0.1 mol/L PIPES，pH 6.9
2 mmol/L EGTA
1 mmol/L MgSO4
1 mmol/L DTT ( 或 DTE)
0.1 mmol/L GTP
1 mmol/L ATP
2. 把含 ATP 釋放的驅動蛋白和/或細胞質動力蛋白的樣品（總體積最多不超過 1 ml）加樣到梯度上。
3. 樣品用 Beckman SW41 轉頭在 4℃ 以 31500 r/min 離心 16 小時。
4. 收集梯度溶液，每管 0.5 ml。 展開 | 