從肝臟組織中制備細胞核實驗

大鼠

裂解緩沖液 濃蔗糖溶液

超速離心機 組織研磨器

1. 配制裂解緩沖液和濃蔗糖溶液（PMSF 在使用前添加），冰上放置。

裂解緩沖液：

0.25 mol/L 蔗糖網織紅細胞標準緩沖液（RSB）

0.25 mol/L 蔗糖（超級純）

10 mmol/ Tris-HCl (pH7.4)

10 mmol/L NaCl

3 mmol/L MgCl₂

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L PMSF ( 用前從溶于乙醇的 100 mmol/L 貯存液中添加）

濃蔗糖溶液：

2 mol/L 蔗糖 RSB

2 mol/L 蔗糖（超級純）

10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

10 mmol/L NaCl

3 mmol/L MgCl₂

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L PMSF（用前從溶于乙醇的 100 mmol/L 貯存液中添加）

2. 超速離心機（Beckman 的與 SW28 轉頭兼容型）和轉頭預冷到 4℃。

3. 將組織研磨器（55 ml 的研磨腔； Thomas C 型腔和鋸齒型 Teflon 研杵，3431-E25）。量筒和燒杯放到冰上。

4. 在一冰桶的冰上放一玻璃盤。

5. 處死大鼠，取出肝臟，稱重。

6. 在一玻璃盤上，用剃刀片快速去除結締組織，將 20 g 肝臟切成大約 1cm³ 的小塊。

7. 將肝臟碎塊裝入含 40 ml ( 兩倍體積）裂解緩沖液的冷的燒杯中。

8. 將大約 30 ml 這種肝臟碎塊和緩沖液混合物倒入預冷的組織研磨器腔中。

9. 將研杵連到推進器，便其滑到研磨腔中，直到觸到緩沖液面。然后握住研磨腔側面，打開推進器。逐漸加大推進器速度直至其最高速度，同時穩定地將研磨腔沿轉動的研磨向上推進。當研杵到達研磨腔底部時，向下拉研磨腔直到所有勻漿都從研杵旁通過，然后再將研磨腔沿研杵推回。重復該過程 5~10 次后關掉推進器。

10. 檢查細胞的裂解效率：

(1) 將研磨腔放到冰上，取出 10 μl 裂解液，用 1 ml 裂解緩沖液稀釋。

(2) 取 2.7 μl 稀釋后的裂解液加到載玻片上，再加上 2.7 μl 含 10 μg/ml Hoechst 染料（33258 10 mg/ml；Molecular Probes 或其他供應商）的裂解緩沖液，然后用一 18 mm^₂ 的 1 號蓋玻片將液滴蓋上。

(3) 比較亮的 DNA 染色的細胞核與同一視野的相圖。

(4) 如果裂解細胞數少于 95%，加大推進器速度，繼續研磨樣品 5~10 次。

11. 在一漏斗中裝入 4 層粗孔濾紙，放到一埋在冰浴中的量筒中，然后將勻漿倒進漏斗。

12. 裂解剩余的肝臟碎塊，勻漿通過濾紙過濾與其余裂解物樣品混和，記錄得到的裂解物體積。

13. 將裂解物體積除以 6，再從離心管體積（35~38 ml) 中減去該體積。即可確定加入 6 個離心管中的濃蔗糖溶液的體積。在 2 mol/L RSB 溶液中加 PMSF 至終濃度為 0.5 mmol/Lol/L。取適當體積（通常為 25~30 ml ) 加到離心管中，冰上放置。

14. 向離心管中加入濃蔗糖溶液和等體積裂解物（通常 7~9 ml )。加裂解物時，應將移液管頭靠在離心管內壁上部使裂解物緩慢流下，這樣可減少裂解物與蔗糖溶液的混和。

15. 將離心管放到預冷的轉桶中，對面的轉桶用裂解緩沖液平衡。

16. 轉桶在 SW28 轉頭上裝好，放進預冷的離心機中，23000 g，4℃ 離心 30 分鐘。

17. 吸出裂解物和蔗糖溶液，或者在一燒杯上將離心管倒轉將液體倒出。用一無絨紙巾清除內壁上的殘余物質，離心管放置于冰上。每管加入 2 ml 裂解緩沖液重新懸浮沉淀。

18. 將沉淀的重懸浮液集中到一個 50 ml 的離心管（錐形或圓形底）中，加裂解緩沖液至 50 ml 終體積，在醫用離心管中 1500 g 離心 5 分鐘。

19. 吸出上清，細胞核沉淀重懸浮于 1 ml 的裂解緩沖液中。取出少量樣品稀釋 100 倍后在血球計數板上計數細胞核數目。

20. 用裂解緩沖液將樣品稀釋到期望濃度的兩倍，加入等體積甘油，放液氮中冷凍，-80℃ 保存。