從雞胗提取鈣調蛋白實驗

雞胗 2-巰基乙醇 緩沖液 H(10X)

聚丙烯燒杯 勻漿器 聚碳酸酯離心管 超速離心機 帶刻度的聚丙烯量筒 粗棉布 聚丙烯漏斗

材料與設備

雞胗（25 個；保存于-20°C)(如，Pel-Freez,Inc.)

2-巰基乙醇（2-ME; 分子量 78.13Da; 密度 1.114)

聚丙烯燒杯（4000-ml)

勻漿器（如，BrinkmarmPolytron)

聚碳酸酯離心管（6x500-ml)

超速離心機，備有 3000-ml 體積的轉頭

帶刻度的聚丙烯量筒（4000-ml)

粗棉布

聚丙烯漏斗（大的，寬嘴型)

試劑

緩沖液 H(10X)

(配方，見“試劑的配制”PP.82~83)

操作程序

1) 取雞胗，室溫下解凍 2 h, 然后 4°C 過夜。

2) 用手術刀除去每個胗的兩葉之間的白色結締組織，但不必擔心主葉周圍的少量結締組織。棄去結締組織，將胗切成約 1cm³ 的小塊。

3) 稱量清理好的胗組織塊，并記錄重量。

4) 用蒸餾水稀釋 10x 緩沖液 H 儲液 f 配制成 2L1x 緩沖液 H, 每 L 加 70.1ul 2-ME, 使終濃度為 1 mmol/L 2-ME。

5) 將胗組織置 4000-ml 聚丙烯燒杯中，加人 2 倍體積（即，2 ml/g) 的1x 緩沖液 H。例如，若有 400 g 組織，則加 800 ml 緩沖液。于冷室中，將緩沖液中的組織轉移至勻漿器，以接近最髙的速度勻漿三次，每次 30s。

6) 將勻漿倒入 500-ml 聚碳酸酯離心管中，用巴氏吸管平衡（勻漿相當粘稠，故需折去巴氏吸管的尖端使吸管口變大些）。于髙速離心機中，4°C，8000r/min 離心 30 min

7) 將上清倒人置有兩層粗棉布的聚丙烯漏斗中，濾至帶刻度的聚丙烯量筒。讓上清沿量筒側壁注人，使提取物不致產生大量泡沫（如倒啤酒不讓起酒沫那樣）。用刮勺將沉淀物取出，合并，放回聚丙烯燒杯。加 1 倍體積的 1X 緩沖液 H〔以原材料的原始濕重為基礎（見上文第 3 步〕。重復勻漿并離心。

8) 合并第一、二次所得的上清，記錄總體積。留取 0.1%(約 1 ml) 體積的上清供隨后的活性測定用。你將需要知道這兩個體積以作計算。