本方案和方案 4 是以變性質粒 DNA 為模板，使用兩條寡核苷酸和高保真聚合酶引導 DNA 合成。本方案中，經多輪熱循環全長雙鏈質粒 DNA 將以線性形式擴增，產生一種 DNA 雙鏈上帶交錯缺口的突變質粒（Hemsleyetal.1989)。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。
| 實驗材料 | 帶 hsdR17 基因型的感受態大腸桿菌菌株 |
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| 試劑、試劑盒 | ATP含有四種 dNTF 的混合溶液誘變緩沖液NaOHNaACTE噬菌體 T4DNA 連接酶噬菌體 T4 多核苷酸激酶DpnI 限制性內切酶熱穩定 DNA 聚合酶瓊脂糖凝膠寡核苷酸引物質粒 DNA |
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| 儀器、耗材 | 帶障蔽的自動微量移液器用吸頭微型離心管微量滴定板可調式移液器能設定所需擴墻參數的熱循環儀 |
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| 實驗步驟 | 材料
緩沖液和溶液
貯存液，緩沖液和試劑的成分請參閱附錄 1。
將貯存液稀釋到合適的濃度。
ATP(10 mmol/L)
含有四種 dNTF 的混合溶液，每一種 dNTP 濃度為 5 mmol/L
10X 長 PCR 緩沖液（用于混合的 DNA 聚合酶）
500 mmol/L Tris-Cl(室溫下 pH9.0)
160 mmol/L 硫酸按
25 mmol/L MgCl2
1.5 mg/ml BSA
由廠商提供的緩沖液和熱穩定 DNA 聚合酶緩沖液可替代上述緩沖液。
或
10x 誘變緩沖液（適宜用于 Pfu 聚合酶類似產品）
100 mmol/L KCl
100 mmol/L 硫酸銨
200 mmol/L Tris(pH8.9 在室溫下)
20 mmol/L MgSO4
1%Tirton X-100
1 mg/ml 無核酸酸的 BSA
NaOH(1mol/L）/EDTA(1mmol/L)(選用）
NaAC(3mol/L，PH4.8)(選用）
該溶液用做中和試劑，因此 pH 值稍低于正常分子克隆中使用的 NaAC 溶液。
TE(pH8.0)
酶和緩沖液
噬菌體 T4DNA 連接酶（選用）
噬菌體 T4 多核苷酸激酶（選用）
DpnI 限制性內切酶
熱穩定 DNA 聚合酶（例如，PfuDNA 聚合酶）
本方案所述工作條件適合于 Pfu Turbo DNA 聚合酶。然而這一工作條件也可適合于其他熱穩定 DNA 聚合酶或聚合酶混合物。Stratagene 公司銷售的 Pfu 有三種形式：天然產生的由克隆的基因表達生產的重組酶以及由重組 PfuDNA 聚合酶和一個新的特性未知的但能夠提髙擴增產物的產量而不改變 DNA 擴增精確度的熱穩定_因子組成的 PfuTurbo 酶。廠商聲稱 Turbo DNA 聚合酶能夠擴增長度為 15kb 的 DNA 片段。按我們的經驗，當雙鏈質粒 DNA 的長度超出 7~8kb 時擴增效率降低。
凝膠
含 0.5% 溴化乙錠的 1% 的瓊脂糖凝膠。
請見歩驟 8。
核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物
關于寡核苷酸引物設計的建議請見本方案介紹和信息欄中關于誘變寡核苷酸的相關內容。如果用 FPLC 和 PAGE 純化寡核苷酸引物降低鹽類污染水平會得到最好的結果（請見第 10 章方案 1 或 5）。將純化后的引物以 20 mmol/L 濃度溶于水中。
質粒 DNA
用于誘變的模板 DNA 是含有目的基因或 cDNA 的環狀質粒。通常質粒越小靶 DNA 擴增效率越髙。小于 7kb 的質粒擴增效率較高；然而長度為 11.5kb 的質粒也已被成功的用做 DNA 模板。質粒 DNA 以 1ug/ml 的濃度洧于含低濃度 EDTA(<0.1 mmol/L) 的 1 mmol/L Tris-Cl 中。
專用設備
帶障蔽的自動微量移液器用吸頭
微型離心管（擴增用 0.5 ml 薄壁管）或微量滴定板
可調式移液器
能設定所需擴墻參數的熱循環儀
如果熱循環儀不帶加熱蓋裝置，使用礦物油或石蠟油防止 PCR 過程中液體蒸發。
其他試劑
本方案步驟 14 需要的試劑列在第 1 章方案 23 中。
本方案步驟 15 需要的試劑列在第 1 章方案 1 中。
本方案步驟 16 需要的試劑列在第 12 章方案 3,4 或 5 中。
載體和細菌菌株
請見附錄 3。
帶 hsdR17 基因型的感受態大腸桿菌菌株（例如，XLl-Blue，XL2-Blue MRF'或 DH5a)
方法
用誘變引物擴增靶 DNA
步驟 1 和 2 可做可不做（請見步驟 3 后的注釋)。
1. 將 1~10ug 質粒 DNA 溶于 40ul H20 中，再加入 10ul 1mol/L NaOH/1 mmol/LEDTA 溶液。37°C 孵育 15 min 變性質粒 DNA 模板。
2. 加入 5ul3mol/L(pH4.8) 中和上述反應液，再加入 150ul 預冷的乙醇沉淀 DNA。
3. 在微型離心機上 4°C 離心 10 min 收集變性的質粒 DNA。小心棄去乙醇上清，用 150ul 70% 乙醇清洗沉淀物。重新離心 2 min 后棄上清，室溫下使所有的乙醇蒸發。將 DNA 重新混懸在 20ul 水中。
理論上不需要將質粒 DNA 模板變性。如果忽略堿變性步驟，超螺旋的天然雙鏈 DNA 將在 PCR 的第一次循環過程中經 94°C 加熱變性。需要步驟 1 和 2 的原因是由于質粒 DNA 在堿性環境中變性后所處的狀態。在 0.2mol/LNaH 溶液中. 質粒 DNA 可折疊成高密度不可逆的變性狀態，用這樣的質粒 DNA 做 PCR 模板. 轉化細菌的可能性極小。因此大大降低了含未突變野生型 DNA 克隆的背最（Du et al.1995,Dorrell et al.1996)。相比而言，盡管 PCR 第一個循環 95°C 的溫度打破了 DNA 雙螺旋結構，但并沒有必定摧毀質粒 DNA 的轉化能力。未經突變的親本質粒 DNA 分子在轉化后獲得的克隆中含有較高的比例。直到實驗的后期，當研究人員面臨篩選克隆、鑒定含有突變 DNA 的任務時，堿變性的意義才顯示出來。如果誘變效率低，且 Dpn Ⅰ篩選無效時，含野生型 DNA 分子充隆的比例之髙往往是無法接受的。
4. 用 0.5 ml 的無菌微量離心管，設置一系列含有不同量（例如 5,10,25,50ng) 質粒 DNA 和恒定數量的兩種寡核苷酸引物。
10X 誘變緩沖液 5ul
模板質粒 DNA 5~50ng
寡核苷酸引物 1（20 mmol/L) 2.5ul
寡核苷酸引物 2(20 mmol/L) 2.5ul
dNTP 混合物 2.5ul
加水至 50ul
加入 2.5 單位的 Pfu Turbo DNA 聚合酶。
注意按以上次序加入試劑，以減少由 Pfu Turbo 3‘-5'外切核酸酶活性產生的引物的降解。
5. 如果熱循環儀沒有加熱蓋，加入 1 滴（約 50ul) 輕礦物油或 1 滴石蠟覆蓋反應混合物，防止樣品在反復加熱和冷卻循環過程中蒸發。將離心管放置在熱循環儀中。
6. 用表中列出的變性、退火、聚合時間和溫度條件進行擴增。
注：以上時間適用于 0.5 ml 薄壁管和反應體系，在 Perkin-Elmer 9600 或 9700 型，Master Cycler(Eppendorf), 或 PTC100(MJ Research) 熱循環僅上孵育。若使用其他類型的設備和反應體系，需要調整反應需要的時間和溫度。
單堿基置換反應需要采用 12 個循環進行線性擴增；單個氨基酸置換（通常相臨的兩至三個堿基罝換）使用 16 個循環；插入或缺失任何大小的 DNA 片段. 使用 18 個循環。
P/u 在擴增反應中催化的 DNA 合成速率比 Taq 慢 1.5~2.0 倍。
使用少量循環次數和大量起始模板，可以降低質粒 DNA、基因或 cDNA 在擴增過程中產生的假突變。
7.DNA 擴增反應完成后，需將反應產物置于冰上。
8. 從每一份擴增反應中取出 10ul 反應產物，通過 1% 的瓊脂糖凝膠（含 O.5ug/ml 溴化乙錠）電泳檢査靶 DNA 擴增情況。按照常規取 50ng 未擴增的線狀質粒 DNA 和 1kbDNA 梯度分子量標準為參照物。
如果擴增效率低，設計--系列反應，優化出適當的循環參數和擴增反應所需成分的最佳量。
擴增產物的連接和轉化
步驟 9~12 可做可不做，通常只用于誘變效率低時（例如當構建插入或缺失時)。
9. 用苯酚: 氯仿抽提擴增 DNA 兩次，乙醇沉淀。
10. 將 DNA 重新懸浮在：
10X 噬菌體 T4 多核苷酸激酶緩沖液 5ul
10 mmol/L ATP 5ul
噬菌體 T4 多核苷酸激酶 5 單位
加水至 50ul
37°C 孵育反應1h,68°C 加熱 10 min 滅活激酶。用酚: 氯仿抽提磷酸化的 DNA 兩次，乙醇沉淀收集 DNA。
11. 把上述磷酸化的 DNA 沉淀（每種大約 0.9ug）重懸在 90ul TE 中。設計一系列磷酸化 DNA 濃度范圍在 0.1~1ug/ml 的連接反應。
磷酸化的 DNA (10 至 100ng)
10x 噬菌體 T4DNA 連接酶緩沖液 10ul
10 mmol/LATP 10ul
噬菌體 T4DNA 連接酶 4 單位
加水至 100ul
16°C 孵育反應 12~16 h。
如果廠商提供的 10X 噬菌體 T4 連接酶已含有 ATP。省去上述連接反應中的 ATP 成分。
盡管理論上已弄懂了有利于環狀單體形成的連接反應條件（Collins and Welssman 1984), 但實際上卻很難做到。為了有利于形成分子內環化而不是分子間以鏈狀連接，DNA 分子的摩爾濃度必須很低。然而當使用反向 PCR 擴增產生 DNA 時，因為無法得知末端未受損傷的全長 DNA 在 PCR 產物中的比例，因此很難計算出適當的 DNA 濃度。
12. 苯酚: 氯仿抽提 DNA 連接產物兩次，乙醇沉淀收集 DNA。將 DNA 沉淀重懸在 45ul 水中，每管加入 5ul l0 倍的 DpnⅠ緩沖液。
13. 直接加入 10 單位 DpnⅠ至步驟 7 剩余的擴增反應物中，或加入到步驟 12 磷酸化和連接的 DNA 中以消化 DNA。用移液器上下吸打幾次將試劑混勻。在微型離心機中離心 5s,37°C 孵育 1 h。
如果 PCR 反應是在存在礦物油或石蠟油的情況下進行，應注意一定要將 DpnⅠ加到反應混合物的水相中。使用帶屏蔽的微最吸樣器吸頭，保證吸頭的尖端插在礦物油或石蠟油覆蓋層下邊。
14. 按照第 1 章方案 23 描述的過程，分別取 1、2、5ul 消化的 DNA 轉化大腸桿菌受體菌。
保證不要把礦物油從消化反應混合物帶入到感受態細胞中。使用超級感受態大腸桿菌細胞 XL2-Blue MRF'(Stratagene) 及修改的轉化過程有利于回收突變體轉化的搡作過程（Dorrell et al.1996)。然而按我們的經驗, 實驗室自己制備的大腸桿菌感受態足可以用于大多數的環型誘變實驗。
15. 從至少 12 個單獨的轉化子中制備質粒 DNA。然而如果突變導致一個新位點產生或毀壞或者把插入、缺失引進了模板，通過 DNA 序列分析，寡核苷酸雜交（方案 7) 或限制酶消化少量質粒 DNA 的方法篩選 DNA 突變體。
16. 序列分析全部的靶 DNA 片段，驗證產生的預定突變體，而在擴增過程中有無假突變體生成（請見第 12 章方案 3,4,5)。
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