以磁性顆粒為基礎純化PCR產物實驗

乙醇 PCR 樣品

自動定位器 吸頭 液體處理自動機械 分離裝置 平板密封條 PCR 純化系統

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

乙醇，80%

2. 核酸和寡核苷酸

在 96 孔板中的 PCR 樣品（不多于100ul/孔）

3. 特殊設備

3 臺單位置的實驗用自動定位器（BeckmanCoulter)

4 套 P250 盒裝吸頭（BeckmanCoulter)

4X4 位置實驗用自動定位器（BeckmanCoulter)

96 孔吸頭洗滌自動實驗用定位器（BeckmanCoulter)

加熱和冷卻自動實驗用定位器（BeckmanCoulter)

液體處理自動機械，如 BiomekFx 或 Biomek2000 實驗室自動工作平臺（BeckmanCoulter)

MagnaBot96 磁性分離裝置（Promega)

無浸透性的平板密封條

回旋振蕩式自動實驗用定位器（BeckmanCoulter)

吸頭裝卸自動實驗用定位器（BeckmanCoulter)

平板夾 96(Promega)

4. 其他

WizardMagneSilPCR 純化系統 [Promega; 包括 MagneSilYellow(順磁性顆粒）、洗滌液、無核酸酶的水和收集板]

二、方法

下述方案中的步驟和時間安排是為在開發機器人自動處理的過程中使用 MagneSilPCR純化系統而提供的，該步驟以及所用試劑的體積也可以用于手工處理過程中。該體系適用于從 100ul 樣品中純化 PCR 產物。

1.DNA 的結合

(1) 從儲存于 96 孔板中的 PCR 樣品開始，用無核酸酶的水將各樣品的體積調整至 100ul。

(2) 振蕩 MagneSil 顆粒使之充分重懸，然后將其向每孔中分別加入 100ul。

(3) 上下抽吸 4 次以混合孔內的物質。

(4) 室溫下溫育 2 min, 溫育 lmin 后上下抽吸 4 次進行混合。

(5) 將已混合的樣品轉移到 96 孔收集板內，將板置于 MagnaBot96 磁性分離裝置上以顆粒磁化。

(6) 移棄上清液。

2. 洗滌

(1) 從 MagnaBot96 磁性分離裝置上取出含順磁性顆粒的收集板，然后向每個孔中加200ul 洗滌液。

(2) 上下抽吸 4 次以混合孔內物質。

(3) 將收集板置于 MagnaBot96 磁性分離裝置上以使顆粒磁化。

(4) 移棄上清液。

(5) 從 MagnaBot96 磁性分離裝置上取出收集板，向孔內加入 200ul80% 的乙醇。

(6) 上下抽吸 4 次以混合孔內物質。

(7) 將收集板置于 MagnaBm96 磁性分離裝置上以使顆粒磁化。

(8) 移棄上清液。

(9) 用 200ul80% 的乙酵重復步驤 (5)~(8)，使乙醇洗滌次數達到 2 次。

(10) 將板留在 MagnaBot96 磁性分離裝置上干燥 5?10 min, 從孔中吸去所有殘留乙醇。

3.DNA 的洗脫

(1) 從 MagnaBot96 磁性分離裝置上取出板，加入 lOOul 無核酸酶的水以從順磁性顆粒上洗脫 PCR 產物，上下抽吸 4 次以混合孔內物質，室溫下溫育 2 min。

(2) 將收集板豎于 MagnaBot96 磁性分離裝置上以使顆粒磁化。

(3) 將洗脫的 PCR 產物轉移到干凈的收集板中。

(4) 如洗出液仍攜帶有顆粒，將收集板放置于 MagnaBot96 磁性分離裝置上并將洗出液轉移到干凈的收集板中，或者也可以在從收集板中轉移樣品時將收集板放置在 MagnaBot96磁性分離裝置上。

(5) 用無浸透性的平板密封條將板緊封，4°C 儲存 1?2 天或-2°C 長期儲存。