以PCR為基礎的相關技術

　　（一）巢式PCR

　　定義：

　　是對靶基因進行二次擴增，第二次擴增用的模板就是第一次的擴增產物。

　　應用：

　　可以得到足夠和特異性的擴增產物，在靶基因表達量比較低或者一些其他原因導致的，使用常規的PCR無法得到理想的產物得時候。

　　注意事項：

　　（1）第二次擴增的時候，必須至少有一條引物是另外設計的。不能直接用第一次擴增時的引物，為保證最終產物的特異性。

　　（2）第一次擴增得時候應該進行較少的循環次數，以合適的產物濃度作為第二次擴增的模板。

　　（二）逆轉錄PCR

　　定義：

　　由于DNA耐高溫聚合酶是不能以總RNA或者mRNA為模板進行核算擴增，必須先將總RNA或者mRNA進行逆轉錄生成cDNA。再用此做為模板進行PCR擴增。

　　應用：

　　合成cDNA探針、cDNA克隆、檢測RNA病毒和分析基因表達等。

　　逆轉錄生成cDNA的方式：

　　（1）可用隨后進行PCR擴增的引物為逆轉錄的印物，可以與目的mRNA的3”末端互補，進行逆轉錄合成次DNA。

　　（2）以合成的寡聚脫氧胸苷酸為引物，mRNA3”端多聚腺苷酸尾互補，在逆轉錄酶的作用下合成cDNA。

　　（3）以人工合成的隨機序列六核苷酸混合物為模板，這些引物可以和mRNA鏈上面任何位置的特異序列互補。引發逆轉錄反應。可以得到較完整的次DNA。

　　（三）定量PCR

　　定義：

　　是一種半定量又稱相對定量PCR技術

　　注意事項：

　　（1）需要引入內參照系統

　　（2）需確保反應處于平臺期時對產物進行檢測

　　（3）在繼續定量分析時應該先對擴增產物進行電泳分離

　　（四）多重PCR

　　定義：

　　是需要在同一反應體系中加入多對引物，同時擴增一份DNA樣品中同一靶基因的多個不同序列的片段或者多個不同靶基因的片段。

　　應用：

　　可以檢測基因較大，突變較多的樣本。例如迪謝內肌營養不良的治病基因。

　　（五）單細胞PCR

　　定義：

　　樣本主要取自于生物體的組織或者是體液，從其中提取到DNA或者mRNA經過轉錄后，合成cDNA作為擴增的模板。

　　應用：

　　神經生物學、胚胎發育、干細胞生物學和基因克隆和文庫的構建，免疫學腫瘤等各種研究領域。在基因的定性和定量檢測中，也起到了廣泛的作用。

　　單細胞P C R的技術，關鍵是如何獲得單個完整的細胞。

　　目前針對這一問題比較常用的方法包括以下幾個：

　　膜片鉗技術，激光顯微切割技術以及流式細胞儀分選和顯微吸管技術。

　　注意：

　　常規的PCR技術是需要從樣本中提取提取和純化DNA或者RNA，但是從單個細胞中獲得材料極少為避免模板的損失，一般不進行純化，而是進行細胞裂解cDNA合成乃至PCR的操作都需要在一個反應管中進行。

　　（六）原位PCR

　　定義：

　　是需要從組織細胞中提取出模板DNA或者RNA還要在不破壞細胞結構的情況下，在細胞原位進行PCR擴增。從而提高了檢測的靈敏度。

　　引用：

　　（1）在腫瘤性疾病中研究細胞中原癌基因和抑癌基因表達的變化和表達量對都改變對細胞功能的影響。

　　（2）某些細胞中特異性表達以及在亞細胞結構中的定位。病毒感染中哪些細胞是病毒感染的原發灶等問題。

　　原位PCR與常規PCR的主要區別在于模板的制備。

　　原位雜交PCR技術是在原位雜交細胞定位技術上與PCR技術的相結合，其檢測靈敏度大大提高。