在動力學測量中，儀器設置和測量參數取決于熒光和化學發光的反應速度，正確的設置是進行成功實驗的關鍵。本文列舉了過氧化氫/過氧化物酶檢測（熒光法）、ATP檢測（化學發光法）、鈣離子檢測（化學發光法）三種類型的動力學實驗，通過這些實例來展示如何根據反應速度來選擇儀器設置和測量參數的方法。
在酶標儀上進行熒光和化學發光測量的優勢在于可進行高通量的測量。為了獲得最佳的實驗結果，反應的動力學速度將決定所需儀器的必備條件和測量參數的設置。如果需要通過向微孔板中加入試劑開始反應，那么選擇手工加入試劑（如移液槍）還是使用自動進樣器分液，這取決于該反應的速度。如果加入試劑后，反應的熒光或化學發光信號迅速上升，達到峰值后迅速下降，那就意味著手工加樣不能滿足檢測的需要。這是因為加樣后檢測的時間延遲會降低反應的檢測靈敏度，因此具有快速動力學特點的反應必須在配備有自動進樣器的儀器上進行。特別的，如果反應速度極快，這就要求儀器不僅需要自動進樣器，而且分液位與測量位必須在同一位置，只有這樣才能保證實時跟蹤反應的進程。
在一些動力學測量中，往往要求在加入試劑開始反應前先測量一段基線信號。對于這樣的應用，用戶必須能夠對動力學測量過程進行設置，使得分液可以在動力學測量的特定時間點進行。
對于在微孔板上進行的動力學實驗，根據需要選擇進行“整板”、“單孔”或“組”（多個孔）進行測量十分關鍵。如果屬于快速動力學反應，那么必須在完成第一個孔中的所有操作步驟（如分液后讀數）后才能繼續下一個孔的測量，即以“單孔”的方式進行實驗。否則，當測量其它孔時，會損失信號強度，或將無法獲得正確的動力學起飛點數據。而如果動力學之間的間隔時間足夠長，那么可以將試劑先預分至所有孔中，然后以“整板”的方式進行測量。當然，也可以根據反應速度，選擇多個孔構成一組，以“組”的方式進行。
分液器的設置也是十分重要的。在軟件中必須能夠對分液速度進行優化，粘度越大的液體需要更快的分液速度。優化的分液速度還能保證所加入的試劑與孔中原有溶液之間的充分混合。如果分液速度過低，將導致孔內溶液的混合效果不好，而速度過快，試劑就有可能濺出孔外。
在當前的一些應用中，常常包括了多個分液步驟，這就要求儀器具有配備多個自動進樣器的能力。例如，雙報告基因檢測系統DLR（Promega, USA）需要兩步的試劑分液，因而二個自動進樣器對于DLR實驗而言是必須的。
材料與方法
所有的熒光和化學發光實驗都在Varioskan Flash全波長多功能讀數儀（Thermo Scientific）上進行。使用SkanIt軟件（Thermo Scientific）進行參數設置。
Amplex? Red過氧化氫/過氧化物酶檢測試劑盒（Invitrogen, USA）應用于熒光的動力學檢測。在過氧化物酶的存在下，Amplex Red試劑與過氧化氫反應生成異吩惡唑酮（Resorufin），該化合物可通過熒光法檢測，激發光波長550nm，發射光波長590nm。取50ul終濃度為100uM的Amplex Red和2mU/ml的辣根過氧化物酶（HRP）混合液，加入96孔黑板Microfluor 1（Thermo Scientific）中，進行熒光動力學檢測。選擇在動力學起始點或第五個時間點加入50ul濃度為10uM的H2O2激活反應。
使用兩種類型的ATP檢測試劑用于化學發光的動力學檢測。一種是CheckLite? HS Set（Kikkoman Corp., Japan），另一種是ATP Biomass HS Kit（Biochemist AB, Sweden）。這兩種試劑盒的反應原理都是通過螢火蟲熒光素酶催化底物D-luciferin和ATP產生化學發光，但前者屬于快反應（flash，閃光型），后者屬于慢反應（glow，輝光型，發光持續時間更長）。取30ul的0.01uM ATP加入384孔白板Microlite 1+（Thermo Scientific），然后通過自動進樣器分別加入閃光型或輝光型的30ul試劑后開始反應。對于閃光型反應，測量的積分時間是1s，動力學時間間隔為0（即以儀器所具有的最小動力學時間間隔進行測量），反應總時間10min。對于輝光型反應，積分時間是500ms，1min時間間隔，反應總時間60min（即60+1個時間點）。
另一個實例是反應速度極快的化學發光反應——應用水母發光蛋白（Aequorin）檢測鈣離子。Aequorin是鈣離子的特異性指示劑，可以與鈣離子結合產生藍色的化學發光信號。取1pmol的AquaLite?重組Aequorin（Invitrogen, USA）加入96孔白板Microlite 1+（Thermo Scientific）中，通過自動進樣器加入10ul的500mM CaCl2溶液進入微孔板中激活反應。測量的積分時間是10ms，間隔時間0，反應總時間10s。
在不同時間點（起始點和第五個動力學點）加入H2O2激活Amplex Red反應的熒光動力學曲線，如圖1所示。在SkanIt軟件中，可以靈活的設置動力學過程中的分液時間點，見圖2。選擇在動力學的起始點就分液啟動反應，則檢測所得的信號就是反應的熒光強度。而在第五個時間點加入試劑，則動力學過程測得的前4個點數據代表的是反應的熒光本底信號水平，軟件生成的動力學曲線將自動扣減本底。
圖1. Amplex Red反應的熒光動力學曲線。RFU表示相對熒光強度。藍色線代表在動力學起始點就加入啟動試劑，而紅色線代表在第五個動力學時間點加入試劑。
圖2. 在SkanIt軟件中，可任意設置動力學過程中的分液時間點。
閃光型和輝光型化學發光反應的動力學曲線如圖3所示。對于閃光型反應，化學發光信號在自動進樣器分液后的4s達到信號的峰值，然后化學發光信號水平迅速下降，其信號半衰期約為2min。這一結果表明，對于閃光型化學發光反應，使用自動進樣器是必須的。因為手工加樣無法跟上反應的快速進行，將會嚴重降低反應的靈敏度。此外，該動力學過程必須以“單孔”的方式進行，只有在完成一個孔的所有動力學檢測后才能對下一個孔繼續測量。
圖3. 閃光型（A）和輝光型（B）化學發光反應的動力學曲線比較。
對于輝光型反應而言，化學發光的信號水平在一定時間內是相對穩定的。試劑加入后的1min內，化學發光強度達到峰值，之后緩慢下降，即使是1小時后，反應仍有約70%的化學發光信號水平。因而，對于這樣的反應，可以對整板進行手工分液后再檢測。少許的時間延遲對反應的檢測并沒有太大的影響。但使用自動進樣器分液，對于輝光型反應，可以獲得比手工分液更好的數據重復性和可靠性。
閃光型和輝光型反應的速度不同，因而必須對軟件作出相應的不同設置，如圖4所示。對于閃光型反應，動力學的時間間隔必須足夠短，因此動力學讀數必須按“單孔”（well loop）的方式進行，即在一個孔中完成所有的步驟后再繼續到下一個孔。而對于輝光型反應，分液和連續的動力學測量可以按“整板”的方式進行，這是因為動力學之間的時間間隔足夠完成所有檢測孔的測量。
圖4. 閃光型和輝光型化學發光反應動力學在SkanIt軟件中的設置。
水母發光蛋白（Aequorin）檢測鈣離子的化學發光反應動力學過程，如圖5所示。通過自動進樣器加入鈣離子的0.5s后，反應的化學發光強度達到峰值，隨后迅速下降，信號的半衰期為2s。10s反應時間后，殘留的信號水平小于10%。對于這類反應速度極快的化學發光反應，必須在分液后立即進行測量，否則就會檢測不到真實的化學發光反應強度。而且，自動進樣器的分液位與測量位必須在同一位置，只有這樣才能保證真正的沒有延遲的分液后測量。在SkanIt軟件的設置中，反應的積分時間必須設置的足夠短，如本例的10ms，否則會損失反應動力學的真實細節。而檢測方式，顯然必須以“單孔”的方式進行。此外，還必須保證足夠快的分液速度（見圖6），以滿足反應速度的要求。
圖5. Aequorin檢測鈣離子的化學發光反應過程
圖6. SkanIt軟件中的分液器速度設置
結論
正確的熒光和化學發光的反應動力學檢測取決于檢測儀器的設置和測量參數。選擇合適的儀器設置和優化的測量參數將能很大程度的改善反應的檢測靈敏度。使用自動進樣器可以幫助獲得可靠的、重復性的測量結果，消除手工分液的誤差。更重要的是，如上所述的多種反應類型，如果沒有自動進樣器是不能完成檢測的。