本品系用傷寒沙門菌培養制成懸液,經甲醛殺菌,用PBS稀釋制成。用于預防傷寒。
1 基本要求
生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
2 制造
2.1 菌種
生產用菌種應符合“生物制品生產檢定用菌毒種管理及質量控制”的有關規定。
2.1.1 名稱及來源
采用傷寒沙門菌CMCC 50098(Ty2株)和CMCC 50402。
2.1.2 種子批的建立
應符合“生物制品生產檢定用菌毒種管理及質量控制”的有關規定。
2.1.3 種子批的傳代
主種子批菌種啟開后傳代次數不得超過5代;工作種子批菌種啟開后至接種生產用培養基傳代次數不得超過5代。
2.1.4 種子批的檢定
2.1.4.1 培養特性
將待檢菌種接種于肉湯瓊脂、馬丁瓊脂或其他適宜的培養基,置37℃培養18～20小時,應為無色半透明、邊緣整齊、表面光滑濕潤的圓形菌落。
2.1.4.2 染色鏡檢
應為革蘭氏陰性桿菌。
2.1.4.3 生化反應
發酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇均產酸不產氣;不發酵乳糖、蔗糖(通則3605);氧化酶試驗陰性。
2.1.4.4 血清學特性
(1)玻片凝集試驗
待檢菌種的新鮮培養物與Vi及H-d參考血清有強凝集反應(+++以上),與O-9參考血清不產生凝集反應或僅有較弱凝集。
(2)定量凝集試驗
將待檢菌種的新鮮培養物,用PBS制成6.0×108/ml的菌懸液,與傷寒沙門菌參考血清做定量凝集試驗。充分混勻后,置35～37℃過夜。肉眼觀察結果,以(+)凝集之血清最高稀釋度為凝集反應效價,凝集效價應不低于參考血清原效價之半。
2.1.4.5 毒力試驗
用35～37℃培養12～16小時的瓊脂培養物,以0.85%～0.90%氯化鈉溶液稀釋成含菌6.0×108/ml、3.0×108/ml、1.5×108/ml及7.5×107/ml等濃度的菌懸液(根據菌種毒力情況,稀釋度可作更改)。每一稀釋度的菌懸液腹腔注射至少5只體重14～16g小鼠,每只0.5ml,觀察3天。小鼠感染后3天內全部死亡的最小劑量為1個最小致死量(MLD),1MLD含菌應不高于1.5×108。
2.1.4.6 毒性試驗
將35～37℃培養18～20小時之瓊脂培養物混懸于PBS內,56℃加溫1小時(或其他方法殺菌),不加抑菌劑。殺菌檢查合格后稀釋成6.0×109/m1、3.0×109/ml及1.5×109/ml 3個濃度,每個濃度的菌懸液以0.5ml腹腔注射體重15～18g小鼠5只,觀察3天,注射含菌7.5×108之小鼠應全部生存,注射含菌1.5×109之5只小鼠可有3只死亡。
2.1.4.7 免疫力試驗
將經56℃ 30分鐘加溫(或用其他方法殺菌)不加抑菌劑的菌液稀釋為2.5×108/ml。用該菌液免疫體重14～16g小鼠至少30只,每只皮下注射0.5ml,注射2次,間隔7天,末次免疫后9～11天進行毒菌攻擊。免疫組小鼠每只腹腔注射0.5ml含1MLD的毒菌,同時應用同批飼養或體重與免疫組相同的小鼠3組(每組至少5只)作對照,分別于腹腔注射2MLD、1MLD及1/2MLD的毒菌(各含于0.5ml中)。觀察3天,對照組小鼠感染2MLD及1MLD者應全部死亡,感染1/2MLD者有部分死亡。免疫組小鼠存活率應不低于70%。
免疫力試驗也可用LD50攻擊法。將經56℃30分鐘加溫(或用其他方法殺菌)不加抑菌劑的菌液稀釋為2.5×108/ml。用該菌液免疫體重14～16g小鼠至少30只,每只皮下注射0.5ml,注射2次,間隔7天,末次免疫后9～11天進行毒菌攻擊。用培養12～16小時的菌苔,以pH 7.2～7.4的肉湯培養基或0.85%～0.90%氯化鈉溶液稀釋至適當濃度,進行攻擊。免疫組小鼠應感染100LD50以上的毒菌。同時應用同批飼養或體重與免疫組相同的小鼠3～4組(每組至少5只),分別感染不同劑量毒菌作對照。免疫組及對照組分別腹腔注射0.5ml,觀察3天,計算LD50。免疫組小鼠存活率應不低于70%。
應同時用參考菌苗作對照。
2.1.4.8 抗原性試驗
選用體重2kg左右之健康家兔至少3只,用經56℃30分鐘加溫(或用其他方法殺菌)不加抑菌劑之菌液靜脈注射3次,每次0.5ml,第一次注射含菌7.0×108,第二次注射含菌1.4×109,第三次注射含菌2.1×109,每次間隔7天。末次注射后10～14天采血做定量凝集試驗測定效價,2/3家兔血清之凝集效價應不低于1∶12800。
2.1.5 種子批的保存
種子批應凍干保存于8℃及以下。
2.2 原液
2.2.1 生產用種子
工作種子批檢定合格后方可用于生產,將工作種子批菌種接種于改良半綜合培養基或其他適宜培養基,制備生產用種子。
2.2.2 生產用培養基
采用pH 7.2～7.4的馬丁瓊脂、肉湯瓊脂或經批準的其他培養基。
2.2.3 菌種接種和培養
采用涂種法接種,接種后置35～37℃培養18～24小時。
2.2.4 收獲
刮取菌苔混懸于PBS中即為原液。逐瓶做純菌檢查,取樣接種瓊脂斜面2管,分別置35～37℃培養2天,24～26℃培養1天,如有雜菌生長應廢棄。
2.2.5 殺菌
在純菌檢查合格的原液中加入終濃度為1.0%～1.2%的甲醛溶液,置37℃殺菌,時間不得超過7天,再保存于2～8℃。
2.2.6 殺菌檢查
殺菌后,取樣接種于不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養基及普通瓊脂斜面各1管,置35～37℃培養5天。如有本菌生長,可加倍量復試1次。如有雜菌生長應廢棄。
2.2.7 合并
殺菌檢查合格之原液按不同菌株或不同制造日期分別除去瓊脂及其他雜質,進行合并。合并后應加入不高于3.0g/L的苯酚或其他適宜抑菌劑,保存于2～8℃。
2.2.8 原液檢定
按3.1項進行。
2.2.9 保存及有效期
原液應保存于2～8℃。原液自收獲之日起至用于菌苗稀釋不得少于4個月,自收獲之日起,有效期為30個月。
2.3 半成品
2.3.1 配制
稀釋前應先將不同菌株所制之原液按菌數等量混合,但每個菌株所加的菌數與應加菌數在總菌數不變的原則下允許兩個菌株之間在40%范圍內互有增減。用含不高于3.0g/L的苯酚或其他適宜抑菌劑的PBS稀釋。稀釋后濃度為每1ml含傷寒沙門菌3.0×108。
2.3.2 半成品檢定
按3.2項進行。
2.4 成品
2.4.1 分批
應符合“生物制品分包裝及貯運管理”規定。
2.4.2 分裝
應符合“生物制品分包裝及貯運管理”規定。
2.4.3 規格
每瓶5ml。每1次人用劑量0.2～1.0ml(根據年齡及注射針次不同),含傷寒沙門菌6.0×107～3.0×108。
2.4.4 包裝
應符合“生物制品分包裝及貯運管理”規定。
3 檢定
3.1 原液檢定
3.1.1 染色鏡檢
革蘭氏陰性桿菌,不得有雜菌。
3.1.2 凝集試驗
與相應血清進行定量凝集試驗,其凝集效價應不低于血清原效價之半。
3.1.3 濃度測定
按“中國細菌濁度標準”測定濃度。
3.1.4 無菌檢查
依法檢查(通則1101),應符合規定。
3.1.5 免疫力試驗
無菌檢查合格后進行本試驗,抽檢批數應不少于生產批數的1/5。按2.1.4.7項進行,每組小鼠至少15只,60%免疫小鼠存活為合格。
3.2 半成品檢定
無菌檢查
依法檢查(通則1101),應符合規定。
3.3 成品檢定
3.3.1 鑒別試驗
與相應血清做玻片凝集試驗,應出現明顯凝集反應。
3.3.2 物理檢查
3.3.2.1 外觀
應為乳白色懸液,無搖不散的菌塊或異物。
3.3.2.2 裝量
依法檢查(通則0102),應不低于標示量。
3.3.3 化學檢定
3.3.3.1 pH值
應為6.8～7.4(通則0631)。
3.3.3.2 苯酚含量
應不高于3.0g/L(通則3113)。
3.3.3.3 游離甲醛含量
應不高于0.2g/L(通則3207第一法)。
3.3.4 菌形及純菌檢查
染色鏡檢,應為革蘭氏陰性桿菌。至少觀察10個視野,平均每個視野內不得有10個以上非典型菌(線狀、粗大或染色可疑桿菌),并不應有雜菌。
3.3.5 無菌檢查
依法檢查(通則1101),應符合規定。
3.3.6 異常毒性檢查
依法檢查(通則1141),應符合規定。每只豚鼠注射劑量為1.5ml。
4 保存、運輸及有效期
于2～8℃避光保存和運輸。自生產之日起,有效期為18個月。如原液超過1年稀釋,應相應縮短有效期(自原液收獲之日起,總有效期不得超過30個月)。
5 使用說明
應符合“生物制品分包裝及貯運管理”規定和批準的內容。