低溫保存對生物樣本及其生物大分子的影響

引言

生物樣本庫主要是指收集和應用健康及疾病生物體的生物分子、細胞、組織和器官等，包括人體器官、組織、體液或處理過的樣本（DNA、RNA、蛋白等），以及與這些樣本相關的臨床資料、質控、管理等生物應用系統。

在醫學研究中，生物樣本是聯系分子信息與疾病的橋梁。根據使用目的的區別，樣本的保存要求也會有所差別。用于分子標記物提取的樣本需要RNA、DNA、蛋白質等分子信息保存完好，保存過程中未發生降解。例如RNA 的RIN 值是評判RNA 質量的黃金標準，代表了RNA 的完整性。組織切片樣本一般對生物大分子的保存效果不及冷凍，但是可以用于制備組織芯片，進行高通量的免疫組化、原位雜交、DNA、RNA 和蛋白質的定位分析及檢測等實驗研究。此外，病人的病史、病理記錄還有術后的隨訪記錄，都是轉化醫學研究的寶貴資源，為研究結果的分析提供合理必要的參考。保存使用記錄，可以讓使用者了解樣本質量變化的可能誘因，有助于實現樣本研究資源共享。生物樣本庫就是儲存了各種樣本及臨床信息的一個機構或組織，為藥物研發、個性化醫療等轉化醫學研究提供高質量的病理、保存和使用記錄都完整的樣本。樣本的質量直接決定了研究結果的可靠性，樣本保存和使用的每一個環節都直接影響樣本的質量，如組織的冷缺血時間、樣本的保存條件、保存時間、保存方法和使用管理等。

目前應用于生物樣本庫的保存溫度有室溫、4℃、- 20℃、- 80℃和液氮。

1) 室溫: 一般室溫可以保存固定的組織切片，但若要長期保存也應放入- 20℃; 用于提取RNA 的樣本也可以用RNAlater在室溫下保存。

2) 4℃: 可以短時間保存一些待處理的血液、DNA 等樣本。

3) - 20℃: 較長時間保存提取的DNA 樣本。

4) RNA、蛋白質、細胞和組織樣本需要保存在- 80 ℃或者液氮中。

通常所講的生物樣本庫主要保存的都是生物分子信息，并不要求樣本保持活性。廣義來講，永生細胞庫、臍血庫、精子庫等也可列入生物樣本庫的范疇，但是它們要求保存的樣本能夠用于再生或疾病治療等目的，因此保存的樣本要求具有活性，其所采用的技術叫做低溫保存技術。

1 低溫保存技術簡介

1.1 低溫保存的原理

在生物和醫學范疇內，低溫指從稍低于正常體溫（37℃）到-196℃。低溫能抑制生物體的生化活動，在此范圍內，生命活動代謝速度隨著溫度的降低而降低，到達-196℃幾乎完全停止。

生物體雖然在低溫下可以長時間保存，卻極容易在降溫和復溫過程中受溶液凍結、融化和溶液滲透壓變化的影響而損傷。這種低溫損傷主要發生在-60℃～0℃這段溫度范圍。為了避免這些損傷，使樣本存活，需要在降溫前加入適當的保護劑，并針對不同的保存對象設計特定的降溫和復溫程序。

1.2 低溫保存技術的種類

所有的低于體溫（37℃）的保存都可稱為低溫保存。而通常所講的低溫保存技術主要指為了保存活的細胞、組織和器官等，通過添加保護劑進行凍存的方法。主要有兩種方法，一種是慢速冷凍低溫保存法，另一種是玻璃化凍存法。

慢速冷凍低溫保存法的具體步驟是: 先將細胞放在冷凍保護劑溶液中進行預處理，然后用程序降溫儀以較慢的速度降溫。細胞外溶液中水分結冰使溶液的濃度升高，胞內的水分滲出細胞膜，細胞體積收縮，胞內溶液濃度升高; 隨著溫度的降低，上述過程持續進行，到達一定的低溫后，再快速降到液氮溫度，并長期保存在此溫度。此過程是傳熱和滲透兩個因素相互作用的過程，因此對于每一個冷凍對象，都有一個最佳冷卻速率使二者達到最好的配合。

玻璃化凍存法研究的重點是尋求容易實現玻璃化，并且對細胞損害較小的溶液和提高冷卻速率。該法的具體步驟一般是將細胞置于高濃度保護劑溶液，然后迅速投入液氮。保護劑溶液的配方、投入液氮前的平衡程序及復溫洗脫程序是研究的關鍵。

1.3 低溫保存技術的應用

目前，低溫保存技術主要應用于細胞、組織和器官的低溫保存，如干細胞、血紅細胞的保存，精子、卵母細胞的保存，胚胎、皮膚等組織的保存等。目前樣本庫以保存分子標記物為目的，還是使用直接凍存法保存樣本，本課題組正在試驗研究低溫保存技術在生物樣本庫的應用。

1.4 低溫保存技術存在的問題

低溫保存技術雖然可以使細胞、某些組織和器官等保存成活，但是仍然存在一些亟待解決的問題: 主要是低溫保存引起的結構及功能上的損傷和改變，還有其蘊含的生物分子信息也有可能發生改變; 其次低溫保存對場地、設備、資金和管理方面的要求比較高等也是該技術應用面臨的問題。

2低溫保存對樣本的影響

生物樣本庫中用于提取生物大分子的組織樣本一般直接投入液氮，并儲藏在液氮或者- 80℃冰箱。目前認為低溫下基本不會發生生物大分子的降解，樣品可以用于各種分子檢測。但是，由于RNA 與蛋白質的不穩定性，長時間保存也可能帶來不同程度的降解。

添加低溫保護劑保存可以使細胞保持活性，但是由于冰晶損傷、滲透壓損傷及保護劑等外來物質的添加，不可避免會給細胞帶來一定程度的損傷。這些損傷可以是形態上的，也可以是功能上的，還可以是細胞內生物大分子的降解或突變等。

2.1 低溫對細胞、組織形態結構及功能的影響

在低溫保存過程中，由于冰晶的形成和滲透壓的改變，會引起細胞膜的受損和皺縮，進而也會導致細胞、組織形態和功能發生改變。而樣本庫目前采用的直接凍存法會破壞細胞膜，使細胞和組織喪失正常的功能。實驗表明，通過改進保護液的配方和冷凍保存的方法，可以減少低溫帶來的形態結構及功能上的損傷。

2.2 低溫對生物大分子的影響

低溫保存技術對生物大分子的影響直接決定了該技術能否應用于生物樣本庫。只要生物樣本置于低于正常生理溫度的環境下，都會對細胞產生寒冷刺激，這種來自外界的刺激會對細胞正常的生理代謝產生影響，從而影響生物大分子的質量或表達，只是由于溫度高低和時間長短的不同，影響大小會有差異。從分子水平來看，冷凍對膜磷脂、蛋白質和核酸的影響是通過改變疏水和親水反應決定的結構實現的。

2.2.1 低溫對DNA 的影響