除詳細的病史及測定血糖外，還必須具備Whipple三項標準：
①發病多在禁食或用力的情況下；
②注射葡萄糖或口服糖水后臨床癥狀可迅速緩解；
③發作時在成人及兒童血糖低于3.0mmol/L。
對腎上腺及垂體疾病所致的低血糖，進行尿17-酮類固醇、17-羥類固醇、生長激素、ACTH測定，L亮氨酸試驗、高血糖素試驗等，以及顱骨平片或CT、MRI檢查等協助診斷。
