實驗材料 質粒 DNA 模板
試劑、試劑盒 無核酸酶污染的水 [35S] 標記的甲硫氧酸 TNT 快速超級混合液 T7TNTPCR 增強液
儀器、耗材 一 70°C 冰箱 冰浴 微量移液器 離心機 水浴槽 聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置
實驗步驟
―、材料與設備
1) 無核酸酶污染的水。
2)[35S] 標記的甲硫氧酸.:1X105mol/L,lOOOCi/mmol
3) 質粒 DNA 模板
4)TNT 快速超級混合液：主要包括 TNT-兔網織紅細胞裂解物，TNT 反應緩沖液，TNTRNA 聚合酶，核苷二磷酸混合液，l0 mmol/L 精胺和 RNasin(30?60U)。
5)T7TNTPCR 增強液
6) 一 70°C 冰箱
7) 冰浴
8) 微量移液器
9) 離心機
10) 水浴槽
11) 聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置
二、操作方法
(-）以質粒 DNA 為模板進行體外轉錄/翻譯
1) 將 TNT 快速超級混合液從一 70℃ 冰箱中取出后，手握反應管以使其盡快融化。當 TNT 快速超級混合液融化后，將其置于冰上其他組分可在室溫屮融化，然后置于冰上。
2) 參照表 4.4 中的反應體系，于 0.5 ml 或 1.5 ml 的離心管中加入反應混合物，在加入所有的組分之耵，用移液槍輕輕上下吹打混勻。如有必要，可將離心管進行短時的離心以使反應混合物聚集到管的底端。
3) 應設立一個不加入 DNA 的空白對照反應, 此對照反應可用于測量含有放射性標記的氨基酸的反應的背景，
4) 將反應管置于 30℃ 孵育 60?90 min
5) 分析翻譯結果。通過對產物中的放射性標記的氨基酸利用閃爍計數儀進行測定及對翻譯產物的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析，從而鑒定翻譯結果。
(二）以 PCR 產物為模板進行體外轉錄/翻譯
具體操作步驟 H 八-) 以質粒為模板進行體外轉錄/翻譯」中的 1)?5)。
反應
注意事項
1) 通過 TNT 耦聯網織紅細胞裂解物翻譯蛋白質的獲得率和模板有關。在 50ul 的反應體積屮陽性對照質粒葉產生 150?500ng 的蛋白質。
2)—次標準反應的 DNA 的用量為 1ug。-般用 0.2?2.0ug 的 DNA 可得到滿意的結果。當 DNA 的量大于 lug 時并不增加蛋白質的產量。
3) 每個 TNT 兔網織紅細胞裂解物系統中的組分均作了不同的設計. 各組分都作了最優的配力、替換一個組分將會降低得率。比如不能在一個給定的系統中用下 T7RMA 聚合酶替換 SP6RNA 聚合酶。每一個系統的反應中，在 RNA 聚合酶的量一定的情況下，用別的 RNA 聚合酶會導致得率低
4) 用于 TNT 耦聯網織紅細胞裂解物系統翻洋的模板的插人片段必須克隆在-個 SP6、T3、T7RNA 聚合酶啟動子的下游，在合適的翻澤讀碼框中還冇一個 ATG。其他一些序列會影響最終得率，如起始密碼子前后序列效應，5＇和 3＇非翻譯序列，5＇帽子類似物等。如果在編碼區上游含奮如 EMCVmRNA 的內核糖體進人位點或 3＇未端含有 Poly(A), 均可增加翻澤效率。加 m＇G(5)ppP(5)G 類似物則會抑制 TNT 耦聯網織紅細胞裂解物的翻譯，因為這一游離類似物可與翻譯起始因子結合。
5）用 TNT 耦聯兔網織紅細胞裂解物能得到的最大的蛋白質約為 176kDa
6) 在 TNT 耦聯網織紅細胞裂解物系統屮，環型 DNA 和 3 種 RNA 聚合酶均能冇效配套，而線狀 DNA 只適用于 T3、T7 系統，用 SPSRNA 聚合酶的翻譯效率則大大降低。如用線狀 (比如 TNTT7 快速耦聯轉錄/翻譯系統），應在 RNA 聚合酶肩動子的上游有20bp 的序列，以使啟動子的結合冇效.