（二）質粒的大量制備:
1.將5ml轉化菌種接種于500ml LB培養液(含用于篩選的抗生素)中，37℃以225rpm速度振蕩培養12～16小時；
2.10,000rpm，4℃離心15min收集菌體；
3.將細菌懸浮于100ml預冷的STE（0.1M NaCl，10mM Tris.Cl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0）中，12,000rpm離心收集菌體；
4.將菌體懸于10ml細菌懸浮液中，再移至50ml離心管中；
5.加入1ml用10mM Tris.Cl (pH 8.0)新鮮配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，混合后室溫孵育30min；
6.加入15ml新鮮配制的細胞裂解液，上下顛倒混合直至溶液變黏稠為止；
7.加入10ml預冷的中和液，上下顛倒混勻，冰浴10min；
8.12,000rpm，4℃離心20min；
9.將上清通過四層消毒紗布濾入另一50ml離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置10min，12,000rpm，室溫離心5min；
10.棄上清，于沉淀中加入水和RNase，置室溫30min，然后用氯仿/異戊醇(24:1)抽提一次，于上層水相中加入0.1倍體積3M NaAC（pH5.2）和2.5倍體積無水乙醇，-20℃ 沉淀15min，12,000rpm離心15min；
11.棄上清，用75%乙醇室溫洗一次，12,000rpm，離心10min；
12.棄上清，真空干燥或自然干燥質粒DNA；
13.加適量去離子水或TE緩沖液(pH8.0)溶解質粒DNA，-20℃保存備用。
四、 DNA酶切，電泳分離與片段的回收
【實驗目的】
掌握常用限制性內切酶的作用特點以及使用方法。
掌握DNA瓊脂糖凝膠電泳的操作與DNA片段的回收。
【實驗原理】
目的DNA被限制性核酸內切酶水解后產生大小不同的DNA片段，這些DNA片段在一定濃度的瓊脂糖凝膠電泳上可以按分子大小不同而分開，并可以用不同的方法再把這些DNA片段從瓊脂糖凝膠上回收回來。
限制性核酸內切酶水解DNA的活性與酶的單位數，緩沖液的離子強度和反應溫度有關。
【實驗試劑與器材】
限制性內切酶
10×內切酶緩沖液
瓊脂糖
（一）DNA分子的酶切消化
【實驗方法與步驟】
DNA分子用限制性內切酶消化，通常按下列比例進行：
雙蒸餾水 適量
10×內切酶緩沖液 1/10體積
DNA 1μg
限制性內切酶 1/10體積 (DNA用1-10U)
總體積 混勻后37℃溫育 30～120min
（二）DNA酶切片段的瓊脂糖凝膠電泳
【實驗原理】
核酸在pH高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。瓊脂糖凝膠具有多孔的網狀結構，以其為介質進行電泳時，不同大小的核酸可借凝膠的分子篩作用而得以分開。用溴化乙啶染色后，在紫外燈下，可見橘紅色的核酸條帶。瓊脂糖凝膠常制成水平平板狀，電泳緩沖液覆蓋在平板表面，加樣后，通電進行電泳，故稱為潛水式電泳。
【實驗試劑與器材】
1.５×TBE: 54g Tris堿，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，配1升。
2.0.5xTBE: 取5×TBE 作10倍稀釋
3.溴化乙啶液： 10mg/ml水
4.６×載樣緩沖液： 0.25%溴酚藍，40%(W/V)蔗糖水溶液
【實驗方法與步驟】
1.鑄膠 1g瓊脂糖加0.5xTBE緩沖液100ml，在微波爐上加熱融化，冷卻至放在手背不覺燙手（約50℃）后，傾入架有樣品孔形成器（梳子）的微型水平電泳槽中。膠液固化后，倒入0.5xTBE至高出膠面1～2mm，拔出梳子，接好電源線（注意正負極）。
2.加樣 核酸樣品中加入樣品體積1/6的6x載樣緩沖液，混勻后，用移液器加入樣品孔內。
3.電泳 接通電源，施加的電壓應小于5v/cm，待溴酚藍跑至適當位置時，關閉電源。
4.染色和結果觀察 向微型電泳槽內滴加溴化乙啶液，至終濃度約為0.5μg/ml，混勻后放置約30min，在254nm紫外燈下觀察電泳結果，做好記錄。
【注意事項】
1.溴化乙啶是致癌劑，并有中度毒性，實驗中要戴防水手套，不要污染環境。紫外燈下觀察結果時，應戴防護眼鏡。
2.也可將溴化乙啶預先加入瓊脂糖中，使濃度達0.5μg/ml進行配膠。
3.瓊脂糖的濃度一般用0.8%~1.2% ,可隨欲分離核酸分子的大小作調整，分子大用低濃度凝膠，分子小用高濃度膠。分離RNA時要用變性膠。