實驗概要
本實驗提供了一個使用一抗的直接 ELISA 實驗方案。
主要試劑
1. 碳酸氫鹽/碳酸鹽包被緩沖液 (100 mM)
應將抗原或抗體在包被緩沖液中稀釋，從而將它們固定到孔上：
3.03 g Na2CO3
6.0 g NaHCO3
1000 ml 蒸餾水
pH 9.6
2. PBS:
1.16 g Na2HPO4
0.1 g KCl
0.1 g K3PO4
4.0 g NaCl (500 ml 蒸餾水) pH 7.4
3. 封閉液：
常用的封閉劑為溶于 PBS 的 1% BSA、血清、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠。
4. 洗滌液：
通常為 PBS 或含洗滌劑例如 0.05% (v/v) Tween20 的 Tris 緩沖生理鹽水 (pH 7.4) (TBST)。
5. 抗體稀釋緩沖液：
應在 1x 封閉液中稀釋一抗和二抗，以降低非特異性結合。
實驗步驟
1. 將抗原包被到微孔板
1) 將抗原在 PBS 或其它碳酸鹽緩沖液中稀釋至 20 μg/ml 的最終濃度。移取 50 μl 抗原稀釋液到 PVC 微量滴定板的第一排微孔中，使該微量滴定板的微孔上包被抗原。按需要在微量滴定板上進行梯度稀釋。
通常將含純抗原的試樣以低于 2 μg/ml 的濃度加到微量滴定板上。純溶液不是必需的，但是原則上，試樣中超過 3% 的蛋白質應為靶蛋白（抗原）。抗原蛋白質濃度不應超過 20 μg/ml，因為這將使微量滴定板上的大部分可用位點飽和。 |
2)
確保樣品所含抗原的濃度在抗體檢測范圍內。 |
3) 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 2 小時，或在 4℃下孵育過夜。包被孵育時間可能需要某些優化。
4) 棄去包被液，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBS。在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴。
2. 封閉
1) 每孔添加 200μl 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質結合位點。替代封閉劑包括 BlockACE 或 BSA。
2) 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少 2 小時，或如更方便的話，則在 4℃下孵育過夜。
3) 用 PBS 洗滌微量滴定板兩次。
3. 用抗體孵育
1) 添加 100 μl 抗體，其剛在使用前在封閉緩沖液中稀釋成最佳濃度（依照制造商說明書）。
2) 用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育 2 小時。此孵育時間可能需要優化。2 小時通常足以獲得強信號，但如若獲得弱信號，則當在 4℃下孵育過夜時往往會觀察到更強的染色。
3) 用 PBS 洗滌微量滴定板四次。
4. 檢測
1) 使用多道移液器或多檔移液器為每孔分配 100 μl（或 50 μl）底物溶液。
2) 待顯色充分后（如有必要），將 100 μl 終止液添加到微孔。
3) 用酶標儀讀取每孔的吸光度（光密度）。
注意：某些酶底物被認為是有害的（潛在致癌物），因此始終要小心處理并佩戴手套。
5. 數據分析
由系列稀釋液得到的數據繪制標準曲線，濃度標在 X 軸（對數標度）上，而吸光度標在 Y 軸（線性標度）上。通過內插法在此標準曲線上得出樣品濃度。