使用合成核苷酸作探針實驗——在氯化鈉／檸檬酸鈉中雜交

核苷酸

SSC焦磷酸鈉SDS

培養箱水浴鍋

1.  制備雙份的轉印細菌菌落或噬斑的硝酸纖維素濾膜（處理和干烤過）。

2.  在室溫下用3× SDS / 0.1%SDS溶液500 ml 洗膜3~5次。

3.  然后在65℃洗膜至少1.5 h 以上直至過夜。

4.  在預雜交液中37℃預雜交1 h。

5.  在裝有20 ml 以上的SSC雜交液的可封口的雜交袋中可移入多達20張的濾膜。

6.  在毎 個雜交袋中每毫升雜交液加入0.125 ng 至1.0 ng 的每種³²P標記的寡核苷酸。

7.  在以下給定的溫度條件下寡核苷酸雜交14~48 h。

（1）14 堿基——室溫

（2）17 堿基——37℃

（3）20 堿基——42℃

（4）23 堿基——48℃

8.  從雜交袋中取出濾胰，用6×SSC / 0.05%焦磷酸鹽洗膜液在室溫冼膜3~5次，每次 5~15 min。

9.  再用預熱的洗膜液洗膜30 min。預熱溫度與寡核苷酸片段長度有關。

（1）14 堿基——37℃

（2）17 堿基——48℃

（3）20 堿基——55℃

（4）23 堿基——60℃

10.  如果濾膜高于本底放射性活性，則需要將洗膜溫度升高2~3℃，并延長洗膜15~ 30 min。

11.  重新作放射自顯影檢測。但不得超過以下對應的溫度：

（1）14 堿基——41℃

（2）17 堿基——53℃

（3）20 堿基——63℃

（4）23 堿基——70℃

12.  用塑料薄膜包裹濾膜，放好，使用增感屏在-70℃對X光片曝光14~72 h，雙份濾膜均對X光片曝光，如果在同一位置出現曝光點，那么該位置對應的細菌菌落或噬斑為陽性。