采用通過監測產物積累進行的實時反轉錄聚合酶鏈式反應（ RT － PCR ）可以用來驗證基因表達的差異。我們在此報道了一種基于 SYBR Green I 染料進行的實時 PCR 定量方法并通過產物的融解曲線來確定在基因表達譜方法中確定的基因表達差異的重復性。因為 SYBR Green I 染料是一種非特異性的結合染料，所以反應使用了"熱啟動" PCR 以及通過經驗性數據來確定退火以及檢測產物的溫度。相對的基因表達水平可以通過使用一系列的 cDNA 濃度做出標準曲線來進行定量。使用這種方法，實時 PCR 可以確定 DNA 陣列 71% （ 17 ／ 21 ）的準確性，和 91% （ 1 ／ 31 ）的差異顯示的準確性。驗證 DNA 陣列的基因表達差異與雜交信號的強弱有關。實時 RT － PCR 結果表明 DNA 表達差異在 2 － 4 倍間的差異無法判斷其正確錯誤與否。而差異顯示 PCR 的結果驗證不依賴于信號的強度。無論是何種基因表達譜技術（微陣列， DDPCR ，基因表達系列分析技術還是差異雜交技術），如果已經知道目的基因的序列，那么實時 RT － PCR 方法就可以適用于驗證這些差異表達，因為它具有定量功能而且需要的 RNA 量比傳統方法要低 1000 倍。
DNA 陣列（微陣列）和差異 RT － PCR 方法是兩種可靠的確證基因表達和基因組廣泛轉錄本差異的方法。這些技術確定樣本表達差異的重復性和敏感性的可靠性受到幾個因素的影響。微陣列的實驗結果受到陣列產物、 RNA 提取、探針標記、雜交溫度條件和圖像分析（ 1 － 4 ）的影響。 DD － PCR 結果受到電泳分辨率、弱和差異引物、條帶確證和結合部分的影響。因為這些可靠性上的限制，被確定為差異表達的基因要經過另一種方法的檢測。 Northern 雜交或者 RNA 酶保護分析都是有效的但是至少要 5mg 的 RNA 。傳統的逆轉錄聚合酶鏈式反應（ RT － DDPCR ）要求的 RNA 要少一些，但其終點分析缺乏定量上的精確性（ 6 － 8 ）。實時 RT － PCR 技術方法是當前最新的確定基因表達的方法，在這篇報道中，我們詳細描述了使用實時 PCR 技術和其與 DNA 陣列以及 DD － PCR 技術的相互結合，來驗證基因表達的正確性。
方法描述 :
基本策略
為了滿足驗證表達譜研究確定的大量基因，我們研究了實時定量 PCR 系統并使用 SYBR Green I 染料。此外，還用每個基因的一系列已知濃度的模板制作了絕對定量曲線，以相對比較不同的樣本。相對定量曲線只需要使用在表達譜研究中確定的一個高表達樣本中獲得的 cDNA 的一系列稀釋度制作完成。
盡管仍然需要設計基因特異性的引物，但不需要設計內在的基因特異性的熒光探針。此外，反應的特異性由產物的 Tm 值確定（ Tm ： DNA 雙螺旋一半解鏈時的溫度）。反應的特異性由"熱啟動" PCR 得到提高，并在低于產物 Tm 值 1 － 2 ℃時獲得信息。這樣就可以避免由通常來說 Tm 值較低的引物二聚體引起的非特異性信號（ 10 ）。
實時 PCR的反應條件
逆轉錄反應條件
使用在基因表達譜分析中采用的總 RNA 進行驗證實驗。采用 SuperScript First Strand Synthesis System 進行 RT-PCR （ Invitrogen, Carlsbad, CA) ）反應來合成 cDNA ，反應體系為 20ul ，里面包含 1 m gDNaseI 處理過的總 RNA ， 20 mM Tris–HCl (pH 8.4) ， 50mMKCl ， 2.5mMMgCl2 ， 10mMdithiothreitol (DTT) ， 0.5 m g oligo(dT)12–18, dNTP （各 0.5mM dATP, dGTP, dCTP, 和 dTTP ） 以及 200 U SuperScript II Reverse Transcriptase 。混合組分時，先混合 RNA 和 oligo(dT) ， 70 ℃保溫 10 分鐘，再放到冰上并加入剩余的反應組分。反應在 42 ℃孵育 1 小時，然后再 70 ℃加熱 15 分鐘終止反應。 cDNA 再加入 2 U 的 RNase H (Invitrogen) 37 ℃孵育 20 分鐘，再在 70 ℃加熱 15 分鐘終止反應。此外用一個沒有逆轉錄酶的反應來驗證是否有基因組 DNA 的污染（無 RT 對照）。 cDNA 在使用前放置在－ 20 ℃保存。進行實時定量 PCR 前不需要進行 cDNA 的純化。
確定實時定量 PCR 的反應條件
使用 GENSET OLIGOS, Oligo Version 4, (GENSET Corp., La Jolla, CA) 或者 LASERGENE 的 PRIMERSELECT 軟件 (DNASTAR, Inc., Madison, WI) 計算產物的 Tm 值來確定反應的退火溫度。摸索退火溫度時，每次以計算得到的 Tm 值增加或減少 2 － 3 ℃，直到其與引物二聚體和非特異性產物間有 3 － 5 ℃的差別。信息采集時候的溫度可以設置到特異性產物的 Tm 值以下 1 － 2 ℃，以減少非特異性產物的干擾。
反應步驟和循環條件
所有的步驟按照儀器的使用說明進行。按照試劑說明將包含有 Tag DNA 聚合酶， dNTP, MgCl2, 和 SYBR Green I 染料的 DNA Master SYBR Green I 混合液與 0.16 m l TaqStart Antibody (Clontech,Palo Alto, CA) 混合一起室溫孵育 5 分鐘，然后再加入引物和 cDNA 模板。除此外，每個反應（ 20ul ）中包含 2ul 的 cDNA ， 0.4 m M 的引物和 4 m MMgCl2 。使用 1:200 和 1:2000 稀釋的 cDNA ，但分析極微量的信息時要求更少的 cDNA 稀釋度。每個稀釋度進行一個重復實驗，同時用一個無模板的陰性對照，這些優化實驗不用于標準曲線。反應條件包括 95 ℃先孵育 60 秒預變性和熱啟動，然后再進行 50 個循環，過程按優化好的實驗結果進行。并最終通過儀器進行一個融解曲線分析。
驗證實驗
實驗條件
通過實驗確定退火溫度和信號讀取溫度后，就可以設置樣品的相對基因表達反應了。 PCR 的反應條件按上述進行。相對定量曲線用兩個重復的預測具有最高表達水平的樣品的一系列 cDNA 的稀釋度（ 1 ： 200,1 ： 2000 和 1 ： 20000 ）進行。并人為地將其數值定為 0.5 、 0.05 和 0.005 。未知模板的的 cDNA 稀釋 200 倍。每個基因都做一個無模板的對照，非 RT-PCR 對照只用一對引物來確定是否有基因組 DNA 的污染。引物為 G3PDH 的引物，并同所有的稀釋為 1 ： 200 的無 RT 模板進行比較。
反應溫度也同上進行熱啟動過程并按照反應條件進行，同時也做融解曲線分析。為了使結果可信，至少三個定量稀釋度中的二個必須特異性的反應（以 Tm 值為交準），而無模板對照在比信號讀取溫度低的時候必須沒有產物和引物二聚體。如果只有一個稀釋度產生了特異性產物，那么則需要重新調整稀釋度來保證至少標準曲線上有兩個可應用的點，如果引物二聚體影響了讀板溫度，就應該調整反應溫度。如果無 RT 對照通過融解曲線分析發現有產物存在，則應用 DNA 酶 I 來消除 DNA 污染。
計算
每組反應都用隨機的軟件進行分析，并按照軟件的操作手冊進行。簡單地來說，就要設定好域值線消除掉無信息的熒光背景信號，標準曲線由儀器自動按照設定好的值生成。軟件能為每個反應自動計算最終的濃度。并最終得到樣本的濃度和相關系數。
使用實時 PCR技術驗證基因表達:
當待檢基因序列已知時可以用上述描述的定量 RT － PCR 的方法來驗證不同基因表達方法（ cDNA 陣列， DD － PCR ，基因表達系列分析以及雜交）得到的結果。這里描述的是用實時定量 PCR 技術來檢測與微陣列與 DD － PCR 方法得到的結果。詳細的步驟在圖 1 中進行了描述。
驗證 DNA陣列結果
可用以上述描述的方法來驗證任何陣列平臺（ cDNA 或寡核苷酸）得到的基因表達差異。例如，我們使用采用基于 cDNA 的高密度陣列（ Atlas Human Cancer cDNA Expression Array; Clon-tech ）來研究 W12 腦上皮細胞的兩個亞克隆 (20863 和 20861) 采用 HPV16 處理不同狀態時的基因表達差異（ 9 ）。用于驗證的基因基于其雜交的熒光強度（亞克隆 20863 作為參考）和相對熒光強度（亞克隆 20863 與亞克隆 20861 ）。
基因特異性引物來驗證陣列結果
對于 Clontech 陣列來說，可以從制造商處獲得基因特異性引物的信息。在本例中，需要的只是合成引物。如果沒有此信息，可以設計基因特異性的引物（使用從 GenBank 中得到的序列信息）以用于驗證結果。引物應當為 17–24 個堿基長，產物大小為 150–650bp 。產物太大的話不適用用于定量擴增。避免基因家族的保守性區域可以得到更好的特異性結果。