使用實時定量PCR技術驗證cDNA和差異顯示PCR技術（二）

實時 RT-PCR 與 DNA 陣列結果的比較

G3PDH 是在大多數細胞中表達的含量豐富的看家基因，但在某些條件下的表達發生改變（ 11 ），通過 DNA 陣列雜交發現， G3PDH 的轉錄本在亞克隆 20863 和 20861 中的表達相同。實時定量 RT-PCR 也發現在兩個亞克隆中有著相同的轉錄水平 (9) ，實時 PCR 的忠實性可以由無 RT 和加水的對照以及每個基因的 CV 值得到證明。每個高強度雜交的基因平均的 CV 值為 12%( 范圍： 1-25%) ，而對于低雜交強度的基因來說則為 18%( 范圍： 18-28%) 。

表 1 計算相對表達水平以及變異系數

變異系數＝標準偏差／平均值＊ 100

變異系數的值由 RT － PCR 的結果決定

. cDNA 和實時 PCR 得到的基因表達結果的變化在表 2 中， 實時 PCR 的結果表明了當雜交信號較高時大多數的 cDNA 差異結果 (88% ， 15 ／ 17) 或者是在不同亞克隆間表達水平的差異可以達到 4 倍的基因得到了確定 (5 ／ 5) 。而在低強度雜交的樣本中只有一個得到了確定 (1 ／ 4) 。總的來說，實時定量 PCR 確定了 81%(17 ／ 24) 的基因。 cDNA 陣列和實時 PCR 得到基因表達量上的差異也有差別。例如，在 14 個由實時 PCR 驗證的基因中，有 10 個表達的差異水平要超過由 cDNA 陣列確定的表達水平。

驗證 DD-PCR結果

DD-PCR 條帶的選擇和基因特異性引物

DNA 陣列和 DD-PCR 技術間主要的差別在于 DD-PCR 條帶上并沒有序列信息。因此，驗證的第一步就是要從 DD-PCR 結果膠中切下目的條帶并從中回收 DNA 。切下選擇的條帶按照熒光 DD-PCR 手冊 (Beckman and Coulter, Inc., Foster City,CA) 進行， PCR 得到的反應結果按照 DD-PCR 的條件進行重新擴增，經凝膠回收后再進行測序。將測序結果中未知序列小于 10% 的條帶用于驗證反應。包含有混合序列的條帶不適用于用于驗證反應，除非能確定主要序列。確定好序列后，就需要設計引物來進行上述的反應。

實時 PCR 和 DD-PCR 結果的比較 s

在本例中，使用優化的熒光 DD-PCR 系統 (Beckman Coulter, Inc.) 來驗證未分化的單層細胞與亞克隆 20861 基因表達的差異。按照熒光強度的不同，將條帶相對的表達水平分為 2-4 倍， 5-10 倍和大于 10 倍。根據絕對的熒光值將條帶分為弱、中等和強三類。（表 3 ）。

條帶 I 設計的引物得到的 . 擴增結果在所有的 cDNA 稀釋度中均有重疊。這表明了條帶 I 在單層細胞與亞克隆中有著相同的表達， DD － PCR 和實時 PCR 得到的結果有一致的。不同稀釋度得到的融解曲線（結果未顯示）表明設計的引物均得到了特異性的結果，實時 PCR 用來驗證了全部的 13 條差異片段。弱及中等強度信號條帶的 CV 值為 10.4% （ 3 － 28.5 ）。而對于強信號的條帶來說則為 18% （范圍： 0.8% ）。實時 PCR 驗證了除了一個外，全部的（ 1 ／ 13,92% ）的 DD － PCR 結果代表了一個已知基因或 EST 。而且不同信號強度的代表了不同相對表達水平。

技術細節 :

  RNA 質量是所有基因表達分析中最重要的變數。商業化的 RNA 提取試劑盒可以得到極好的純度和無降解的 RNA ，這可以適用于酶的反應以及基因表達分析的檢測系統。 RNA 的完整性應當在長時間的保存過程中得到保證，因為基因表達譜分析有時候只能在 RNA 提取的數周或數月后才能進行。總 RNA 應該用 DNase I (0.4 u/ m g RNA) 按照試劑盒的要求進行處理。 RNA 用 UV 分光光度計進行定量，并用甲醛的瓊脂糖電流來檢測降解程度（ 12 ）。

2 ．如果 RNA 的量有限 (10 m g) ，有另一種方法可以替代 DNase I 處理（ 13 ）。方法是在 RT 反應中加入逆轉錄酶之前先用 DNase I 來處理 RNA ，以避免由酚——氯仿抽提時造成的 RNA 的損失。我們在實時 RT － PCR 實驗中驗證了用 DNase I 處理有限 RNA 樣品的效果，非常令人滿意。

3. 如果實驗樣品 RNA 有限，可以用較易獲得的同一種／基因型（人的來自 cDNA 的 RNA 或是來自鼠 cDNA 的鼠 RNA ）的 RNA 用于確定最優化的退火和信號讀取溫度。但是，從這些資源得到的 RNA 應該按照樣品處理的方法進行同樣的處理，因為 Tm 值會受到殘留鹽和其它方法的影響。

4. 有些引物對也許會在不同的引物退火溫度和加熱時間的情況下產生幾個峰的融解曲線。這也許表明引物存在非特異性或者是表達存在不同的剪接轉錄本或者發現有新的基因家族成員。在這種情況下可以把反應樣品從反應管中取出進行凝膠電泳并進行產物測序。

結論 :

采用熱啟動 PCR 和在特異產物 Tm 值以上進行熒光信號讀取可以使基于 SYBR Green I 染料的實時 PCR 變得敏感而特異（ 10 ）。這里描述的技術可以使 cDNA 陣列中高和低強度雜交信號和 DD － PCR 中低到高強度信號的每個基因的 CV 值為 15% 。平均 CV 值低于通常報道的 25 － 25% 。大部分通過 cDNA 陣列和 DD － PCR 方法得到的差異基因可以通過實時 PCR 技術得到確證（采用 1 ： 200 到 1 ： 20000 的 cDNA 稀釋， 20ul 反應體系中加入 1ul 的模板 RNA ）。因為實時 PCR 方法可以采用極低量的 cDNA ，驗證由高通量方法得到的 100 － 1000 個基因只需要 1 m g 的總 RNA 。如采用 Northern 雜交或 RNase 保護方法進行驗證，則至少需要 5 m g 的總 RNA ，這接近于采用實時 PCR 反應分析的 5000 倍。

實時 PCR 技術驗證的不同表達強度信號的 DD － PCR 條帶表明了對 DD － PCR 條帶的驗證并不依賴于條帶的信號強弱。另一方面，雜交信號的強弱和基因的相對表達水平對 cDNA 陣列結果的影響也得到了驗證。與采用的篩選技術相比，實時 PCR 得到的結果在基因表達水平上有很大的不同。這種不同也許是由于采用篩選技術和 DD － PCR 技術時沒有辦法采用特異性的引物來區分同一個基因家族。除非 DNA 陣列技術采用了針對序列特異轉錄本的優化，否則 cDNA 陣列雜交結果就有可能被交叉雜交或重復制的基因家族成員所遮蓋。簡單的，為 DD － PCR 條帶設計特異性的引物也受到序列信息不足和新的轉錄本的限制。實時 PCR 方法作為一種輔助的驗證方法，有可能成為只使用少量 RNA 的情況下，定量大量已知和新基因表達變化的快速的新途徑。

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