使用掃描電鏡觀察細胞樣品的制備方法

一、原理

超薄切片實際上是樣品的二維切片，不能表達細胞的三維結構，而且在觀察切片后所拍攝的顯微照片時，容易造成錯誤的印象，用掃描電子顯微鏡( SEM )能直接觀察標本表面的三維空間結構，真實地反映各種細胞表面和斷裂面的形態特征，其照明源與透射電鏡基本相同，由電子槍經聚光鏡匯聚成極細胞的電子探針，電子探針受掃描發生器控制，在樣品表面逐點逐線的掃描，樣品被電子轟擊所產生的二次電子被收集、轉換、放大，在電視熒光屏上同步掃描成像。二次電子的發射量與樣品的表面形態有關，從而在熒光屏上出現表面起伏的樣品立體圖像。掃描電鏡細胞樣品的預處理包括取材、固定、脫水等。

二、操作基本步驟

1 、取材

掃描電鏡下觀察的樣品尺寸要求比較寬松，一般1cm3左右樣品都能適合大多數掃描電鏡觀察。

2 、固定

鋪片培養的細胞取出浸入 PBS 中，漂洗細胞表面。然后將細胞鋪片放入青霉素小瓶中，加 4 ℃ 預冷的 3% 戊二醛，在 4 ℃ 固定 2h 或過夜，吸出固定劑，用 PBS 浸洗 2 次，每次 10min ，再用 4 ℃ 預冷的 1% 鋨酸。在 4 ℃ 固定 1h ，然后用 PBS 浸洗 2 次，每次 10min 。

3 、脫水

丙酮 / 醋酸異戊酯( 1 ： 1 )脫水 10min ，接下來醋酸異戊酯脫水 30min ，或用系列梯度酒精( 30% 、 50% 、 70% 、 80% 、 90% 、 95% 、 100% )脫水，每種濃度酒精通過 2 次，每次 15min 。

4 、干燥

以臨界干燥法最理想，但必須要有專門的儀器臨界點干燥器。當實驗室不具備此種儀器時，可采用冰凍干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的關鍵是乙腈置換。樣品經上述處理后，浸入 520% 的乙腈溶液中，然后依次更換 70% 、 80% 、 90% 、 95% 、 100% 的乙腈溶液，每次浸泡 15-20min ，最后再換 100% 乙腈。然后進行真空干燥。即將乙腈置換后的樣品連同青霉素瓶一起放到真空鍍膜臺的真空裝置內，抽低真空，一般需 30-50min 。樣品干燥后，待其溫度升至室溫時再放氣，取出樣品。

5 、樣品導電處理

用真空噴鍍法。所用的儀器為真空噴鍍儀，樣品被安置在離蒸發源約 10-15cm 處的樣品臺上，樣品進行旋轉活動，先噴碳。后噴金，噴鍍應均勻，完成后鏡下觀察。