1、患者每次開始應用新生霉素前，必須先進行青霉素皮試。
2、對頭孢菌素類藥物過敏者及有哮喘、濕疹、枯草熱、蕁麻疹等過敏性疾病史者慎用。
3、新生霉素與其他青霉素類藥物之間有交叉過敏性。若有過敏反應產生，則應立即停用新生霉素，并采取相應措施。
4、腎功能減退者應根據血漿肌酐清除率調整劑量或給藥間期。
5、長期或大劑量應用新生霉素者，應定期檢查肝、腎、造血系統功能和檢測血清鉀或鈉。
6、對實驗室檢查指標的干擾：（1）硫酸銅法尿糖試驗可呈假陽性，但葡萄糖酶試驗法不受影響；（2）可使血清丙氨酸氨基轉移酶或門冬氨酸氨基轉移酶測定值升高。