在經典的Western Blot的世界里，蛋白電泳—轉膜—封閉—抗體—顯色這個五步驟環環相扣，構成WB完整過程，就象砌積木一樣，少了前面一步的基礎后面的就砌不上去。但是親愛的朋友，告訴我，你們在一次又一次重復這個貌似簡單又頗為費時的實驗時，有沒有設想過能省略掉其中的某個費時的非必需步驟，更直接更快得到結果呢？那該有多么省事啊！
真的有這樣一種產品，抽掉了WB中費時的非必需步驟——轉膜和封閉，直接在PAGE電泳膠上做免疫印跡！這個幾乎顛覆傳統WesternBlot概念的技術創新，完美演繹了“沒有做不到，只有想不到”這一句話。
經過PAGE電泳分離的蛋白樣本可以在凝膠里直接固定和染色（比如考馬斯亮藍）看結果，但如果要檢測蛋白質特異性就要借助傳統Western Blot的轉膜的步驟，然后在膜上進行免疫反應檢測。仿佛是天經地義似的。可是你有沒有想過為什么一定要轉膜？很簡單：因為凝膠上的蛋白質會發生擴散遷移，需要“固定”，但是“固定”本身會影響蛋白質和抗體的免疫識別反應，所以需要將經過PAGE電泳分開的樣本從電泳膠上共同轉移到穩定的固相支持介質——膜上，使之不能再遷移同時又能保持免疫原性，然后在這個PAGE膠的“影像”也就是印跡上，可以通過免疫檢測目標蛋白的特異性。這個方法借助轉膜克服了一些難題，但是轉膜本身也帶來另一些問題：比如轉膜的不完全性——樣本中各種蛋白的大小和荷電各不相同，在電場中離開PAGE膠遷移速度、與膜的結合能力各有差異，導致轉膜效率潛在差別；比如PAGE膠孔徑和膜的孔徑甚至電流的大小都會影響轉膜效率——非常偶然遇上轉移效率低的蛋白比如Fibrinogen纖維蛋白原，簡直氣昏人。再加上轉膜過程也有可能造成部分蛋白免疫原性的丟失——特別是非變性膠，目標蛋白的部分抗原表位可能會發生變化，導致抗體無法識別檢測。再加上轉膜后膜上的其他空白位點需要進行封閉，以及膜本身對部分檢測方法的不兼容和背景問題，可見費精力又費錢的轉膜這個PAGE的“印跡”有時未必能很好的代表PAGE膠結果本身（這是非常特殊的情況。多數情況還是很好的，不要誤會）。
這般辛辛苦苦的轉膜印跡為的就是避過在凝膠上固定和保持蛋白免疫原性之間的矛盾，如果有辦法可以在PAGE膠上能固定蛋白同時又能保持蛋白免疫原性，不就可以直接在PAGE膠上檢測蛋白特異性，又避免前面這許多麻煩了嗎？還大大節約時間和經費呢。且看生物通為你推薦的2種技術創新的產品——正是這貌似簡單的創新，突破了原來的墨守成規，令未來的WB更加簡單。原來只要我們敢于突破自己原有的框框，就會有更多精彩的發現！
一、Pierce公司：UnBlot In-Gel Chemiluminescent Detection Kit
其實此前也有嘗試改良固定方法使得可以直接在PAGE膠上檢測蛋白免疫原性的，只不過往往要固定和漂洗很多次，甚至需要一天的時間，太過費時和費力而無法令人接受。不過，堅持致力于蛋白質研究工具開發的Pierce公司一直都沒有放棄這種努力。堅持就是勝利，就是UnBlot In-Gel。只要50%異丙醇固定15分鐘，超純水漂洗15分鐘，就可以馬上用一抗孵育，而省掉了轉膜和封閉的步驟！是不是覺得很神奇呢？如果不相信，那就先來看看實驗步驟的比較。
這樣算下來，怎么算都是UnBlot In-Gel的節省吧，節約了轉膜和封閉的3—4小時的時間，更節約了膜的花費，不用再為轉膜效率和轉膜條件而傷神，更不用說花在學習實驗操作上的時間和金錢。但是當然大家會更關心：快是快多了，那么檢測靈敏度和質量又如何呢？固定后的PAGE膠，蛋白不會遷移了，可是抗體和檢測試劑能“滲透”進去的量就有限了。多謝化學發光法的高度靈敏，UnBlot的檢測靈敏度是1ng，和經典的ECL化學發光法相當，不單適合壓片顯影，也適合CCD成像系統檢測，絕對滿足一般實驗的檢測要求。雖然從檢測極限的數字上看起來好像不如那些動輒pico、Fremo的檢測試劑盒那么高，但是要把在轉膜過程中的蛋白損耗和被破壞的抗原決定簇算在內啊，可能也差不多了。UnBlot防止了這2種情況的發生并且幫助不易轉膜的蛋白檢測，這可是怎么也不能換算的啊！
除了上面所說的這兩點， 對于實驗結果的分析，UnBlot由于無需轉膜，因此可以在化學發光顯色并記錄后再進行總蛋白的染色，無論麗春紅S、考馬斯亮藍，氨基黑等等或者Pierce的GelCode Blue Stain Reagent都可以檢測后染色，比較蛋白免疫反應的特異性，方便判斷實驗結果。而且想一想，這可是在原位檢測哦，真正保持一致性。另外由于UnBlot是在膠上檢測，那也就是說可以reprobing啰，如果你的樣本珍貴，要檢測幾種蛋白（比如一個基因表達的變化可能會引起幾種相關蛋白表達的變化），你就可以很方便的洗掉原來的抗體，換個抗體檢測其他目標蛋白！是不是很節約時間和樣本呢? 至少不用再跑電泳了啊。只檢測一個蛋白也可以用reprobing優化反應條件，這為我們獲得漂亮的結果可是大為有益的。
還有一個問題就是適用范圍的問題，以前UnBlot只能用于Invitrogen的Novx，Cambrex（以前的FMC，Biowhittak，生物通前面的文章有介紹的），Bio-Rad的Criterion brand Bis-Tris， Tris-Glycine，Tricine和Tris Acetate gels，包括變性和非變性膠，但是不能用于Bio-RadiGel和Zaxis gel。國內畢竟還是自配膠居多，經過改良后的UnBlot也可以用于自制膠了，這個方法距離大家就不再遙遠啦！不過，做膠時要用硅化玻璃和有特殊要求（配膠時不要用SDS）。而就種類來說，UnBlot也可以用于3-8%，4-12%，8-18%，4-20% 和 10-20%的梯度膠，以及8-16%的非梯度膠。至于在蛋白適用性上，UnBlot并沒有什么限定性，目前已有報告成功應用的例子包括20KD到160KD的蛋白。如果硬要說有的話，那就是UnBlot通用試劑盒目前只有小鼠和兔源、生物素3種選擇（還有GST-tag融合蛋白的），如果你一抗不在此列，那么也就沒有辦法，乖乖的轉膜，慢慢的摸索條件吧。
現在UnBlot參考價錢是“貴妃級”的￥5000左右（打折幅度以各人能力為準，嘿嘿，7折也要3500呢），可用于1000cm2膠，說明書說可以用10次（10x8cm）Mini膠，不過我們知道一般Mini膠去掉積層膠后通常不過5cm高，其實用20次應該沒問題的。由于包含了二抗和顯色試劑，還居然有25張X光片和配套的顯色工具盒，呵呵，確實價值不菲。不過可以節約膜、轉膜設備以及奶粉錢，確實可以一試。還有生物素標記方法和GST-Tag的檢測試劑盒。我很期待，也相信，很快會有更方便常規實驗的Unblot系列推出吧。老實說，Pierce還是很值得期待的，畢竟在研究蛋白的領域里有很好的口碑，也有許多很有創意的產品——盡管我們不太熟悉它，相信以后越來越多的目光轉向蛋白研究，會有越來越多人記住這個與Hyclone合并的公司的。哦對了,生物通近期的優秀論文評選,獲獎論文的獎金就可以用于選購Pierce/Hyclone的產品,如果你有文章在《遺傳》《遺傳學報》《中國農業科學》《中國生物工程雜志》上發表，也許可以考慮試試這個東西？
另一個“神奇俠”是來自Invitrogen公司的InVision His-tag In-gel Stain，其實這是個染料，根本就不算Western，但關鍵是巧妙得很，利用熒光染料交聯帶有Ni2+的NTA，其中的Ni2+可以高度親和His-tag，所以可以直接染色PAGE膠，而特異地將樣品中帶有His-Tag的條帶顯示出來，就和用His抗體做Western Blot一樣，又省掉了轉膜、封閉、抗體等等麻煩的步驟，只要紫外或者掃描儀，而且靈敏度很高，達到ng級別。實在是好玩的很吶。如果你的實驗室有表達His tag融合蛋白，一定要搞一個，比買His抗體要好哦，Invitrogen的招牌，應該也沒有人懷疑吧？如果我還告訴你這個試劑盒做一個檢測只需要100多元錢（￥3498，20mini-gels），是不是想買了呢？如果是這樣，那就趕快行動吧。