使用酶標儀的細胞成像系統檢測標簽蛋白的表達

優勢：

1.    帶細胞成像系統的功能模塊擴展了微孔讀板機的檢測應用

2.   方便檢測每個細胞或每孔的標簽蛋白的表達水平

3.   按照一般微孔讀板機的簡單流程

4.   細胞可視化數據輸出，增加了數據可信性

某些細胞蛋白存在或不存在，可代表著細胞對某些刺激的反應、某種分化的狀態或特定細胞類型的獨特特征或者基因的成功轉染。如血管內皮細胞粘附分子-1(VCAM-1)一般不存在于正常的血管內皮細胞，但在細胞因子TNF-α的體外刺激引起的炎癥反應，會出現VCAM-1的表達。這種細胞中某種特殊標志蛋白的表達，可以很容易地使用微孔板成像系統進行檢測和定量。

定量測量細胞標志物的表達

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在96孔板中培養48小時，接著使用抗炎化合物SB202和SB203的不同劑量刺激2小時；然后使用TNF-刺激24小時，細胞表達VCAM-1；然后用4％的多聚甲醛固定細胞，接著使用抗VCAM熒光素標記的抗體染色。使用S p e c t r a M a x M i n iMax細胞成像系統(SpectraMax i3多功能讀板機的用戶可升級模塊)進行細胞成像，影像分析使用Soft-Max Pro軟件內的蛋白表達Protocol實時進行。使用SoftMax Pro的濃度效應曲線擬合，進行化合物的藥效的評價，結果顯示化合物成功地抑制了細胞因子的刺激，從而抑制了后續的VCAM-1的表達。

VCAM-1的表達水平的定量，通過設置熒光強度閾值過濾掉背景熒光和大小閾值過濾掉微小的雜質，如劃痕，顆粒或氣泡。圖1表示在SoftMax Pro中如何進行蛋白標志物的分析設置程序。

熒光素標記的VCAM抗體染色的固定細胞，使用標簽蛋白表達程序進行鑒定，由于細胞幾乎連成一片，所以此程序設置為檢測整個視野內蛋白總體表達，而非是進行單個細胞計數。

圖1 陽性和陰性樣品讀板前的測試分析參數設置

圖1， SoftMax Pro軟件界面擁有幾個可視化的組件，以幫助建立圖像分割最佳參數設置。

1：調整背景強度和對象大小閾值來識別熒光細胞。

2：在陽性和陰性孔內，可視化生成的分割遮罩，以幫助判斷是否需要進一步的參數調整。

3：選擇能展示陽性孔和陰性孔直接較大差異的輸出參數，如直方圖的顯示方式。

標記的表達程序是用來識別熒光素標記的抗VCAM抗體標記的區域。 VCAM-1的存在表示炎癥應答的陽性反應。

圖2 細胞對抗炎化合物的反應應答

左側的圖像顯示熒光VCAM-1表達的細胞，右圖加上紫色遮罩，顯示軟件對表達炎癥標簽蛋白的劃分；高劑量的抗炎化合物SB202處理的細胞(上排)顯示出很少的VCAM-1的表達，而低劑量的抗炎化合物SB202處理的細胞(下排)使用細胞因子后，則表達出大量的VCAM-1。所有的值為經過歸一化處理后的總強度值。

標記表達分析實驗的更多信息

SpectraMax MiniMax細胞成像系統可提供簡單酶標熒光強度檢測值所不能提供的可視化數據和信息。熒光檢測區域可定位到表達感興趣的標簽的細胞，大的成像視野允許將數量龐大的細胞一次整合。友好的SoftMax Pro軟件分析界面，允許進行濃度效應曲線擬合和計算IC50值等。總之，MiniMax細胞成像系統簡化了細胞成像過程，提供了和補充了在細胞標簽蛋白表達檢測方面標準酶標儀檢測所不能提供的重要信息。

圖3 標志物的表達結果分析

頂：微孔板模板中孔的注釋定義。

底：濃度vs標記物表達量的曲線擬合圖。隨著抗炎化合物的濃度的增加，細胞因子刺激的VCAM-1的表達量則降低。歸一化的總信號強度可以使用眾多曲線擬合選項和給出IC50濃度。 SB202 IC50=0.1 μM時，SB203 IC50=1.8 μM。