摘 要
5’-核苷酸廣泛應用于醫藥及食品行業，在世界范圍內核苷酸類藥品、制劑成為研究和投資的熱點之一，需求量日益增長。國內僅個別廠家能進行四種核苷酸生產，且產品純度不高，產量不大，原料不足的問題嚴重制約了我國核苷酸類藥物和衍生物的開發。酶膜生物反應器是在生物化工和膜分離技術的基礎上發展起來的新型反應器，作為生物反應分離耦合過程的一個具體應用，其有不可比擬的優越性，在食品、生物化工、醫藥、環境等領域得到了越來越廣泛的應用。為此本課題開展了酶膜生物反應器制備核苷酸的研究。主要研究了核酸酶P1的制備及分離純化、游離及固定化酶膜生物反應器制備核苷酸、核苷酸的分離純化等。
利用正交及響應面法優化了培養基成分，并對培養條件進行了優化，在最優條件下，可得到核酸酶P1最大酶活性354 U/ml。通過熱失活、超濾、硫酸銨分級沉淀、疏水作用層析、離子交換層析以及凝膠層析等生化分離手段提純得到了電泳純核酸酶P1，酶蛋白比活為1264 U/mg，純化倍數為93.4。研究了核酸酶P1酶學性質，得到了pH穩定性范圍為4.0-7.0，最適pH為5.4；最適溫度為69 ℃；Al3+、Cu2+ 、Co2+ 、SDS對核酸酶P1有明顯的抑制作用，Zn2+、K+對核酸酶P1有明顯的激活作用；米氏常數Km為24.28 mg/ml。
研究了游離酶膜通量衰減曲線，考察了溫度、壓力等對膜通量的影響，優化了游離酶膜生物反應器的操作條件，并通過單因素及曲面響應法確定了游離酶膜生物反應器制備核苷酸的最佳酶解工藝條件：底物濃度1.25 %、鋅離子濃度6.0×10-4 mol/l、底物pH為5.3、加酶量0.080 mg/ml、溫度為65 ℃、底物中醋酸緩沖液的濃度0.125 mol/l。在最佳條件下制備的核苷酸收率為12.15 mg/ml，平均轉化率為97.2 %。
考察了紙纖維為載體的共價偶聯法、殼聚糖微球和DEAE纖維素為載體的交聯法等幾種固定化方法，獲得較優的固定化條件。研究了固定化核酸酶P1的酶學性質，與游離酶相比：最適pH提高0.5個單位，耐酸堿性也得到了提高；以殼聚糖微球和紙纖維為載體的固定化酶最適溫度提高了10 ℃，熱穩定性、存儲穩定性都得到了提高；紙纖維固定化酶、殼聚糖微球固定化酶、DEAE纖維素固定化酶的米氏常數Km分別為5.72、96.58、27.21 mg/ml。
采用化學交聯法和物理吸附法研究了以膜為載體的酶固定化方法，結果表明化學交聯法優于物理吸附法。同時考察了上述幾種固定化酶在膜生物反應器里的使用穩定性，相比較而言殼聚糖微球固定化酶比較適合，使用十次后殘留相對酶活為96 %，核苷酸轉化率為84 %。通過單因素及曲面響應法確定了殼聚糖微球固定化酶在膜生物反應器中制備核苷酸的最佳酶解工藝條件：底物濃度1.57 %、鋅離子濃度6.0×10-4 mol/l、底物pH為5.4、加酶量0.080 mg/ml、溫度為72 ℃、底物中醋酸緩沖液的濃度0.125 mol/l。在最佳酶解工藝條件下可得到最大核苷酸收率為14.52 mg/ml，轉化率為92.5 %。
對酶解產物5’-核苷酸進行了分離純化，先用陽離子交換樹脂IR120分離出5’-AMP和5’-GMP，再用陰離子交換樹脂IRA 400分離 5’-UMP和5’-CMP，考察了上樣量、緩沖液流速、洗脫濃度、離子強度、pH值等因素對5’-核苷酸分離純化工藝條件的影響，四種核苷酸都得到了很好的分離，回收率在80 %以上。