實驗方法原理
實驗材料 重組的 NAP－1純化的果蠅核心組蛋白重組的 ACF質粒 DNA
試劑、試劑盒 HEG 緩沖液KClPvOH PEG 溶液BSA 溶液MgCl2CaCl2重組的拓撲異構酶 Ⅰ 工作溶液緩沖液 R微球菌核酸酶儲液 EDTARNase A糖原終止緩沖液 酚 氯仿 異戊醇乙醇
儀器、耗材 27℃ 和 30℃ 水浴
實驗步驟
1. 實驗前準備
1.1 材料
0.5～4.0 mg/ml 重組的 NAP－1
0.3～2. 0 mg/ml 純化的果蠅核心組蛋白
0.002～0.2 mg/ml 重組的 ACF
1.2 試劑
HEG 緩沖液
300 mmol/L KCl（以 0.1～1 ml 分裝，－20℃ 保存）
PvOH/PEG 溶液
2 mg/ml BSA 溶液（以 0.1～1 ml 分裝，－20℃ 保存）
0.5 mol/L ATP（以 0.1～1 ml 分裝，－20℃ 保存）
0.5 mol/L 磷酸肌酸
5 mg/ml 肌酸激酶
100 mmol/L MgCl2（以 0.1～1 ml 分裝，－20℃ 保存）
0.3～2.0 mg/ml 質粒 DNA，雙 CsCl 純化，溶于 TE 緩沖液中
10×拓撲異構酶 Ⅰ
重組的拓撲異構酶 Ⅰ 工作溶液
ACF 稀釋緩沖液：含有 0.4 mg/ml 重組入胰島素（Roche）的洗滌緩沖液 F
200 U/ml 微球菌核酸酶儲液
緩沖液 R
10 mmol/L CaCl2（以 0.1～1 ml 分裝，－20℃保存）
0.5 mol/L EDTA
10 mg/ml RNase A
糖原終止緩沖液
2.5 mg/ml 蛋白酶 K
50：49：1（V/V/V）酚/氯仿/異戊醇，用 10 mmol/L Tris·Cl， pH 8.0 平衡
2.5 mol/L 乙酸銨
100％ 乙醇
1.3 耗材
硅烷化的 1.5 ml 聚丙烯管子（如 ISC BioExpress， Cat.＃ C－3302－1）
27℃ 和 30℃ 水浴
2. 解凍所有的緩沖液和蛋白質。
所有的緩沖液都必須平衡到室溫（通過不斷的吹吸）。蛋白質必須快速解凍（在室溫水浴中，輕彈混勻或輕柔的渦旋混合，轉移到冰上）并且使用完后應快速冷凍（在液氮中）。ACF、Nap－K 核心組蛋白及微球菌核酸酶（但不包括作為單獨的多肽表達和純化的拓撲異構酶Ⅰ 或 ISWI）可以承受多次的冷凍－解凍循環（大約 10 次）。小量的工作濃度的拓撲異構酶Ⅰ（含有 50％ 甘油）可以儲存于 －20℃ 而不凍結大約 3 個月左右。
3. 在 1.5 ml 硅烷化的微量離心管中加入如下溶液制備 NAP－1 和核心組蛋白（NH）的主混合液：
172 HEG
7 ul 300 mmol/L KCl
84 ul PvOH/PEG 溶液
4.2 ul 2 mg/ml BSA
6.4 ul 2 mg/ml NAP－1
3.03 ul 0.7 mg/ml 核心組蛋白
輕輕地渦旋混勻 2～3 S。
4. 吸取 56.6 ul 步驟 2 中的 NH 混合液（室溫）分別到 5 個硅烷化的 1.5 ml 微量離心管中。冰浴≥20 min 使組蛋白與 NAP－1 結合。
5. 制備 ATP 與鎂離子的主混合液（AM）： 3 ul 0.5 mol/L ATP， 30 ul 0.5 mol/L 磷酸肌酸，16.5 ul 蒸餾水，25 ul 100 mmol/L MgCl2。使用前加入 0.5 ul 5 mg/ml 肌酸激酶。
6. 準備 DNA 模板，將下列溶液混合：
7.64 ul 質粒 DNA（0.42 mg/ml）
2 ul 10×拓撲異構酶Ⅰ緩沖液
2.36 uI 重組的拓撲異構酶Ⅰ工作溶液
8 ul 蒸餾水
30℃ 溫育 10 min 以使 DNA 松弛；放置于室溫備用。
染色質抑制拓撲異構酶Ⅰ對 DNA 的松弛作用。因此，反應中的拓撲異構酶Ⅰ應比經 10 min 的 30℃ 溫育后使超螺旋的質粒完全松弛所需的量超出 5～10 倍。純化的系統在缺少拓撲異構酶時也 可以高效地在線性的超螺旋 DNA 上組裝染色質。在后一種情況下，模板必須有高于 95％ 的超螺旋 DNA（通過兩輪的 CsCl 分帶獲得）。
7. 用 ACF 稀釋緩沖液制備 ACF 稀釋液（2～10 U/ul）。置冰上。
1 U 的 ACF 等于 22 fmol 蛋白質。
8. 按如下所述進行 5 個裝配反應：
8.1 步驟 3 中的 56.6 ul NH 中加入 1 ul ACF（2～10U）。
8.2 從冰上取下管子，平衡到室溫。
8.3 加入 10.5 AM 主混合液（步驟 4），以及 2 ul DNA 模板（使用過量的拓撲異構酶Ⅰ變松弛或超螺旋的；步驟 5）。旋即輕輕渦旋混勻 2～3 S。
8.4 27℃ 裝配 1.5～2.5 h。加了所有組分后輕輕地渦旋混勻反應液，短暫地離心一下并收集溶液至管底。加入 DNA 模板后 馬上混勻反應液是十分重要的。
9. 在馬上使用前，準備兩個微球菌核酸酶在緩沖液 R 中的稀釋液：1：500 和1：1500。
10. 每個反應中加入 17.5 ul 10 mmol/L CaCl2。將每個反應等分為兩份（a 和 b）。隔一定的時間間隔（如 15 s），在 a 管中加入 5 ul 步驟 8 準備好的 1：1500 稀釋液，在 b 管中加入 5 ul 1：500 稀釋液。室溫消化 10 min。
11. 制備終止液（ST）：將 55 ul 0.5 mol/L EDTA 與 11 ul 10 mg/ml 的 RNase A 溶液 混合。每管中加入 6 ul ST 并渦旋混勻終止微球菌核酸酶的消化。室溫放置 5 min 以消化污染的 RNA。
12. 制備蛋白酶溶液（PR）：將 1.1 ml 糖原終止緩沖液與 55 ul 2.5 mg/ml 的蛋白酶 K 溶液混合。每管中加入 105 ul PR，渦旋混勻。37℃ 溫育 ≥ 30 min，以消化組蛋白及可溶性蛋白。使用 200 ul 50：49：1 酚/氯仿/異戊醇抽提。上層水相加入 25 ul 2.5 mol/L 乙酸銨，475 ul 100％ 乙醇沉淀 DNA。
13. 進行瓊脂糖凝膠電泳。