使用HRMAM對NIST單抗的關鍵質量屬性進行監控

　　隨著治療性生物產品在全球藥物市場所占份額的不斷提高，各 國監管機構通過發布質量源于設計（Quality by Design, QbD） 原則等手段，對生物藥的質量控制提出了更高的要求。對于生 物制藥企業而言，在生產及批次放行過程中對關鍵質量屬性 （critical quality attribute, CQA）和雜質等進行鑒定、定量和監 控就顯得尤為重要。傳統的質控手段包括多種分離手段，如反 相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)、體積排阻色譜（size-exclusion chromatography, SEC）、離子交換色譜（ion-exchange chromatography, IEX）和毛細管電泳（capillary electrophoresis, CE）等。

　　2015年，Rogers等基于Orbitrap高分辨質譜平臺發展了MultiAttribute Method（MAM），用于在一針進樣中同時對CQA進行 鑒定、定量和實時監控[1]。自從MAM發布以來，獲得了業界的 極大關注，在近年的學術會議中屢屢成為熱點議題[2]。 在本文中，我們使用Thermo Scientic? Q Exactive? Plus Orbitrap? 高分辨質譜平臺，串聯Thermo Scientic? Vanquish? Flex UHPLC系統，使用Thermo Scientic? Chromeleon? 7.2.9 Chromatography Data System (CDS) 與Thermo Scientic? BioPharma Finder? 3.2 軟件進行數據采集和處理。

Figure 1. Thermo Scientic HR MAM 工作流程圖. 使用BioPharma Finder 軟件對肽圖分析的數據進行分析，與發現階段進行對比以鑒定CQAs； 隨后將BioPharma Finder生成的CQA列表導出至變色龍CDS中進行常規 GMP階段符合合規要求的目標組分檢測。

　　參考之前的報道，在本文的研究中我們選定了如下的CQAs用于 定量：糖基化（glycosylation）、脫酰胺（deamidation）、天 冬氨酸異構化（isomerization）和C端賴氨酸丟失（C-terminal lysine truncation）。對于每個CQA，我們選取了鑒定到的每個 電荷態的前四個同位素峰，在BioPharma Finder中另存為Target Peptide Workbook，并一鍵導出為BioPharma Finder workbook le (.wbpf)，隨后將其導入變色龍 Processing Method中的 MS Component Table。

　　任何新發現的CQA可以隨時添加進BioPharma Finder workbook 和變色龍方法中，這為方法開發和優化階段提供了極大的靈活 性。一旦在變色龍軟件中建立了標準化的分析方法，即可將該 方法應用于GMP環境下的應用中。 接下來，使用Chromeleon CDS 7.2.9軟件進行CQA定量。我們 基于變色龍軟件中的MS Quantitative模板創建了MAM數據處理 的方法，基本參數如表4所示。在變色龍軟件中，可以對峰積分 的參數進行優化，以確保積分結果一致且可信，從而得到準確 的定量結果。

　　實驗結果

　　本次實驗選取的兩份NIST mAb標準品來源于同一批次，通過 對比不同溶液置換耗材處理后選定CQA含量的變化趨勢，進而 研究不同耗材對CQA定量結果的影響。圖2展示了Biopharma Finder對兩個樣品進行肽圖分析的結果，可見在上樣量約4μg肽 段的情況下，NIST mAb標準品輕鏈覆蓋度≥96%，重鏈覆蓋度 ≥98%，除了一些胰酶酶切過短的肽段沒有鑒定到，其余區域均 可鑒定到肽段信息，為CQA的選取和定量提供了堅實的基礎。

Figure 2. 兩份NIST mAb標準品（RA2, 上；RA3, 下）酶解肽段基峰譜 圖（Base Peak Chromatogram）. 對于兩個樣品，我們分別進行了三針技術重復。表5展示了對主 要糖型的定量結果。由圖中可以看出，分別使用不同前處理耗 材的兩個樣品的六針進樣之間均呈現良好的重現性。

　　結論

　　在本實驗中，我們使用基于Thermo高分辨質譜平臺的HR-MAM 流程對在前處理步驟中使用不同溶液置換耗材的NIST mAb標準 品進行了CQA的鑒定和定量。得益于HR-MAM流程的穩健性、 靈活性、特異性和高靈敏度，我們可以在一次實驗中同時對多個 CQA進行監控和定量。 對比不同溶劑交換前處理耗材的實驗結果，可發現肽圖強度、色 譜峰型及分離與肽圖覆蓋度等無明顯差異，且與關鍵質量屬性相 關的特定修飾，使用不同耗材處理得到的定量比率并無顯著區 別，更進一步證明了HR-MAM流程的穩定性。