使用MD SoftMax Pro 7軟件進行平行線分析和相對活性評價
介紹
在生物實驗中要經常要使用到的平行線分析(PLA)方法，當無法直接檢測一個生物制品的活性而只能通過檢測其產生的效果時，PLA方法通常會被用來進行效應曲線的比較來獲得此制品的效果(Figure1)。如果對于兩種物質其生物響應相似或者在兩種不同的生物環境中同一種物質產生相似的效應曲線時，平行線分析法可以被用來進行評價。評價平行性是計算化合物或藥物相對活性的前提，并且在很多生物應用中如藥物活性比較、分析物鑒定、交叉反應、干擾物質、基質補償、濃度估算和抑制效應等應用研究中。
當兩條曲線被判定為平行時，其中一條曲線的函數可以通過通過另一條曲線的函數乘上一個比例系數向X軸的左邊或右邊變換獲得：f(x)=f(rx)，其中x是劑量，r是比例系數或相對活性。對于相對活性，一般將參考品(已知品)的活性設為1，可以使用一個比例系數可以將參考品的曲線變換為測試品(未知品)曲線，那么這比例系數則被稱之為測試品的相對活性。這個方法應用于線性擬合的曲線非常合適，因為線性擬合的曲線在整個濃度范圍內的曲線斜率是保持一致的(Figure2)。可是對于非線性擬合曲線如4-參數和5-參數曲線，S形的濃度效應曲線在整個測試濃度范圍內具有變話的斜率值(Figure1)。
用于評價平行性的方法根據平行性假設的驗證方法不同大致可以分為兩大類：效應比較法和參數比較法。本文將對這兩大類方法進行詳細解釋和介紹怎樣使用SoftMax? Pro 7軟件進行平行性測試。我們建立了一個Protocol包括了使用F-檢驗進行F-檢驗概率測試和使用卡芳-檢驗進行卡芳概率測試。另外，對于參數比較法，根據菲勒定理我們也建立了一個ParallelismTest的protocol放在SoftMaxProProtocol的庫內。所有這些方法都可以被用于評價線性和非線性擬合曲線。
優勢
- 一鍵點擊應用通用約束型模型擬合
- 自動計算相對活性、擬合參數和置信區間
- 預設各種平行線分析模板調用
平行性檢測
效應比較法
生物系統經常會出現不符合預期的現象，并且數據會出現一些噪聲和波動；因此，選擇正確的曲線擬合方式和權重因子，來消除這些噪聲和波動是進行平行性評價前的首要一步。如果選擇了一個不合適的擬合方式，那么可能在平行性評價系統內引入偏差，進而得出錯誤的結論。
由于根據實際實驗中的數據，很難獲得完全平行的擬合曲線，尤其對于非線性擬合回歸，而計算非平行曲線獲得相對活性是很困難的。在效應比較法中，參考品和測試品的曲線會使用約束模型同時進行擬合，在這個模型中，曲線被強制變為平行；而在非約束模型中，兩條曲線會各自進行擬合。通過統計學的方法，來比較約束模型和非約束模型兩種擬合度的差異，這個差異可能是由于非平行性造成的。
在約束模型中，用來描述曲線的所有參數都是一樣的，除了用來描述 X- 值的參數不一樣；線性擬合中，X- 值是指截距，非線性擬合中是指上、下漸近線之間的中值，也就是 EC50 值。SoftMax Pro 軟件具有計算線性擬合的相對活性，也可以使用約束性模型 ( 全局擬合模型 ) 和獨立模型對非線性擬合曲線進行評價和計算相對活性。
- ChiSquaredPLA (PlotName@GraphName): 返回被擬合曲線的卡芳統計值
- ChiProbabilityPLA (PlotName@GraphSection): 返回被擬合曲線的卡芳統計值概率分布值
- FStatPLA (PlotName@GraphSection):返回被擬合曲線的 F- 檢驗值
- FProbPLA (PlotName@GraphSection):返回被擬合曲線的 F- 檢驗值概率分布值
注：以上所有公式只有在曲線擬合選項置中的 Global Fit (PLA) 選項被使用的情況下才可以使用。PlotName@ GraphName 是曲線的全稱，包含圖表的名稱，例如，Plot#1@Graph#1 或 Std@Standardcurve。指定某一條曲線作為公式內曲線是帶有主觀性的，實際上卡方值是從該圖表中的所有曲線數據計算而來的。名稱為“Parallel Line Analysis Using Ftest and Chi-squared Test”的模板，是根據這兩種統計學方法而建立的 SMP 模板。當使用儀器直接獲取到數據或者從外部導入數據到模板中后，所有的計算過程會自動進行，并進行零假設的評估，判斷曲線是否平行。
在這個模板中，F-檢驗和卡芳檢驗的概率值必須大于等于0.95才能認定曲線是平行的。一般來說，這個設置的意思是指有95%的置信度該假設是成立的。置信程度是可以被調整的以適應不同實驗的接受水平。
虛假設測試
在效應比較法中，平行性的計算通常是利用殘差平方和(RSSE)的函數來進行的,以此來判斷約束性模型對數據的擬合效果，另外一個特殊的方法，則是根據附加平方和的分析來進行。這個統計學回歸方法是方差分析(ANOVA)的一種形式，其中虛假設的是約束性模型是正確的或者說曲線是相互平行的。虛假設的驗證，可以使用各種不同的統計學技術，包括概率的F-檢驗或卡方檢驗。在這兩種方法中，概率值會被計算出來，通常這個值介于0-1之間，當這個值接近1時，意味著曲線間的平行性在增大。需要注意的是，F-檢驗是有一定缺陷的，此法對于對獨立模型擬合度很高的曲線可能產生假陽性判斷或者對于獨立模型擬合度很低的曲線產生假陰性的判斷。這兩種方法都被收錄進了SoftMax Pro軟件當中，檢驗值和概率值計算可以通過軟件內的以下公式方便的獲得：