實驗概要
雖然普遍認為供體細胞的類型和基因型影響體細胞克隆的效率，但是對于這個假設的驗證研究卻很少。目前有人從供體細胞類型、供體細胞基因型、供體細胞的類型與基因型三個方面研究了對小鼠體細胞克隆效率的影響。本試驗是研究小鼠克隆效率是否與供體細胞類型、供體細胞基因型、供體細胞類型及基因型有關。
實驗步驟
1. 供體細胞準備
卵丘細胞從2-4月齡成熟母鼠獲得，未成熟睪丸支持細胞從0-5日齡未成熟雄鼠獲得。卵丘細胞通過透明質酸酶脫顆粒細胞獲得。未成熟睪丸支持細胞獲得方法如下：
取下的小鼠睪丸用0.1mg/ml膠原酶與0.01mg/ml脫氧核糖核酸酶37℃處理30min，然后用0.2mg/ml胰蛋白酶37℃處理5min，去睪丸懸液即可。睪丸懸液用含4mg/ml BSA的PBS洗一下就可用于顯微注射了。未成熟睪丸細胞根據其體積與形態即可確認。
2. 受體卵母細胞的獲得
8-10周齡BDF1雌鼠常規超排獲得卵母細胞。7.5IU/只eCG，48h后7.5IU/只hCG。hCG注射后15h脫頸處死小鼠獲得卵母細胞。(培養箱條件：37.5℃，6.2%CO2。)
3. 核移植
MII期受體卵母細胞在37℃條件下去核，操作液為含5μg/ml CB的Hepes-KSOM。BDF1染色體在Nomarski光學鏡下能夠很容易的辨認，利用Piezo裝置將紡錘體及其周圍少量胞質取出。去核的卵母細胞在KSOM液中孵育30min-2h使其胞膜完全恢復。供體細胞在室溫下、Hepes-KSOM液中利用Piezo裝置注入去核卵母細胞中。供體細胞的核沒有必要從細胞質中完全弄出來，因為卵丘細胞與未成熟睪丸支持細胞的胞膜都是軟的，在注射時它們的胞膜很容易破。注射了體細胞的卵母細胞在KSOM中孵育1-2h使體細胞的染色質凝集。重構胚在無Ca2、含3mM SrCl2 與5μg/ml CB的KSOM液中孵育1h，然后在含5μg/ml CB的KSOM液中孵育5h，最后移入單純的KSOM液中培養72h。
4. 胚胎移植
72h后發育到桑囊胚階段的重構胚移植入8-12周齡假孕3d的ICR雌鼠(小鼠見栓當天稱為第一天)子宮中。8-10枚胚胎移入一側子宮(16-20枚胚胎移入一種受體小鼠)。在第20d時，檢測受體小鼠中成活的胚胎，活著的小鼠讓泌乳ICR雌鼠哺乳。
5. 試驗設計與統計學分析
在試驗1中，利用實驗室小鼠品系檢測供體細胞類型與基因型對看了胚胎發育的影響。在試驗2中，檢測了野生型基因型(JF1)與129基因型結合后的基因型克隆小鼠其發育能力是否比單純的JF1克隆小鼠的發育能力強。
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