1、側流免疫層析檢測技術
側流免疫層析檢測技術(LFIA) 也稱橫向流動免疫檢測技術，是出現于20世紀60年代初期的一種獨特的免疫分析方式，以條狀纖維層析材料為固相，借助毛細管的吸附作用使樣品在層析材料上移動，其中樣品中的待測物與層析材料上一定區域的抗體結合，通過酶促顯色反應或直接使用著色標記物短時間獲得直觀的測試結果。
側流免疫層析技術是一種將免疫技術和色譜層析技術相結合的快速免疫分析方法，主要用于病原體，激素，藥物和代謝物等的檢測，原理是通過標記抗原或抗體來識別待檢物。側流免疫層析試紙條主要包括樣品墊、結合墊、層析膜、吸收墊、背襯及應用于試紙條上的各種試劑。根據待檢測物分子的大小不同分為兩種主要類型：雙抗體夾心法和競爭法。
1.1 雙抗體夾心法
雙抗體夾心實驗法是利用捕獲抗體和檢測抗體進行測定。一般用于檢測大分子量的抗體、抗原類物質。大分子量分析物包含有兩個或兩個以上的結合位點，結合墊為著色標記物與待測抗原的特異性抗體(Ab1) 的偶聯物，檢測線為待測抗原的另一表位特異性抗(Ab2) ，質控線為抗Ab1抗體(Ab3) 。當待測樣品中含有一定量的抗原時，樣品通過層析作用到達結合墊位置，抗原和Ab1發生反應，與檢測線的抗體形成雙抗體夾心復合物，達到一定量后，通過沉積的標記物顯示待檢物的量。殘留的抗體繼續泳動到質控線位置，與Ab3反應而顯色，得到陽性結果，見圖1。樣品中不含抗原，標記物和檢測線抗體不發生反應，而質控線顯色，得到了陰性結果。檢測線和質控線均不顯色時，表示試紙條無效。
1.2 競爭法
小分子量分析物只有一個抗體結合位點，使用競爭免疫試驗進行檢測。競爭法有兩種類型，一種是檢測區固化的是待測抗原或待測抗原的類似物。結合墊上為著色標記物與待測抗原的特異性抗體(Ab1) 的偶聯物。當樣品中含有待測抗原，樣品待檢測抗原與Ab1結合，由于競爭抑制作用，檢測線處抗原不再發生反應，檢測線處不顯色，隨后，抗原抗體復合物與抗Ab1抗體Ab2相結合，在質控線處顯色，如圖2。反之，隨著抗原濃度的顯色加深。另一種在檢測區固化的是待測抗原的特異性抗體(Ab1) 。結合墊上為著色標記物和待測抗原或待測抗原類似物偶聯物。通過樣品中抗原和抗原偶聯標記物競爭結合檢測線上抗體，達到檢測的目的。
 |  |
| 圖1 雙抗夾心法原理示意圖 | 圖2 競爭法原理示意圖 |
2、側流免疫層析技術在真菌毒素檢測中的應用
側流免疫層析是一種將免疫技術、色譜層析技術和免疫標記技術相結合的固相膜免疫分析方法，這種層析技術常常是借助外來的標記物獲得可測量的信號來分析結果。因此，有必要尋求一種高靈敏的免疫標記物，建立準確、快速、簡便的真菌毒素檢測方法。
納米粒子一般是指顆粒尺寸在1～100nm 范圍內的超微粒子。它具有表面效應、小尺寸效應、量子效應、宏觀量子隧道效應等特性。與正常粒子相比，納米粒子具有大的比表面積，其光、熱、磁敏感特性和表面穩定性較高。同時，納米材料用于生物分析標記物質，可大大改善標記物的性能，顯著提升現有分析方法的靈敏度及特異性，其在抗原抗體的標記上具有很大的應用潛能。納米材料的引入為免疫層析技術實現高靈敏，高特異，快速檢測奠定了良好的基礎。采用側流免疫層析技術對真菌毒素進行檢測當中應用最為廣泛的標記物是納米粒子。
用于毒素檢測的納米粒子標記物按材料可分為熒光納米粒子、金納米粒子以及磁性納米粒子等。其中熒光納米粒子又包括量子點及其量子點微球、熒光微球以及時間分辨熒光微球等；金納米粒子包括常規膠體金及AgAu復合納米粒子等。
2.1 熒光標記免疫層析技術
2.1.1 量子點層析技術
量子點(Quantum dots，QDs)又稱無機半導體納米晶體，是一類由Ⅱ-Ⅵ族(如CdSe，CdTe，CdS，ZnSe等) 或Ⅲ-Ⅴ族(如InP，InAs等) 元素組成的納米顆粒。量子點的粒徑一般介于1～10nm之間，由于電子和空穴被量子限域，連續的能帶結構變成具有分子特性的分立能級結構，受激后可以發射熒光。其中，CdTe是最重要的納米材料之一，常被用作生物標記探針。量子點作為一類理想的新型熒光探針，與傳統的熒光染料相比，它具有寬的紫外線激發光譜和狹窄對稱的熒光發射光譜；可精確調諧的發射波長；可忽略的光漂白等優越的熒光特性； 良好的光化學穩定性； 熒光壽命長，可接受多次激發等優越的熒光特性，因此，可以很好地應用于熒光標記。在免疫分析中應用是一個值得引起重視的新領域。
由半導體材料構成的納米熒光顆粒-量子點，因其具有更穩定、更強的熒光特性，并可以進行多信號的同時檢測，已有研究者將其用于熒光免疫標記檢測AFB1及ZEN。Ren等制備了一種量子點微球免疫層析試紙條，用于快速檢測玉米中AFB1，線性范圍為5～60pg/mL，檢測熒光強度與AFB1含量在該質量濃度范圍內呈良好的線性關系，檢出限為0.42pg/mL，檢測時間為15min，與膠體金標記試紙條相比檢出限低兩個數量級。
量子點探針用于層析法，既提高了靈敏度、特異性，又可實現快速、定量檢測，在免疫層析中有廣闊的應用前景和發展潛力。相比膠體金探針，量子點應用的報道較少，其研究剛剛起步，在制備、修飾及抗原抗體標記環節技術要求高，偶聯結合物后的穩定性等方面有待進一步提高。
2.1.2 基于時間分辨熒光免疫分析的層析技術
時間分辨免疫層析快速檢測技術(Time-resolved fluorescent immunochromatographic assay，TRFICA) 是集時間分辨熒光免疫分析技術和層析技術的優勢，借助高靈敏的標記示蹤物，用于微量物質檢測的一種新興技術。示蹤物由兩種不同鑭系元素離子(分別作為光吸收子和發射子) 及陶瓷顆粒(作為主基質) 摻雜組成，優于免疫層析常用標記物膠體金，它具有較高的靈敏性，高穩定性，可通過時間分辨熒光免疫層析分析儀結合標準濃度曲線實現定量分析。
張兆威等采用Eu3+包覆于硅膠形成的硅膠熒光微粒作為免疫標記物，將AFB1抗體與乳膠銪進行偶聯標記，建立AFB1時間分辨熒光免疫層析快速檢測法。與已有的膠體金免疫層析快速檢測方法相比，該方法的靈敏度提高了1～2個數量級。該試紙條用于花生、稻米、植物油等農產品檢測，檢出限均為0.3μg/kg。相對誤差小于10%，說明該試紙條可用于農產品中AFB1快速檢測。
2.1.3 熒光微球免疫層析法
熒光微球免疫層析技術是利用熒光微球表面修飾的羧基可共價結合抗體，通過該標記物發出穩定而強的熒光信號進行定量檢測的新型檢測技術。該標記物發光強度受激發光強度增強而增強，并且受外界影響小，已有用于毒素檢測的研究。
Liu等建立了基于熒光微球探針的免疫層析法，該法可用于快速篩查受AFB1污染的醬油樣品。所制試紙條的檢測探針由熒光微球和抗AFB1的抗體交聯組成，該探針的光學特性消除了醬油樣品的顏色干擾，可視檢出限達到2.5μg/L，低于我國政府制定的限量標準(5μg/L) 。結果表明，熒光微球作為標記物的免疫層析技術在有色樣品的檢測中有較高的研究價值和前景。
2.2 膠體金免疫層析技術
2.2.1 膠體金免疫層析法
免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標記物，應用于抗原抗體反應中的一種新型免疫標記技術。隨著納米技術的興起和單克隆技術的發展，免疫膠體金技術成為繼熒光素標記技術、放射性同位素標記技術和酶標記技術后發展起來的又一種固相標記免疫測定技術，已廣泛用于醫學臨床診斷、動植物檢疫、微生物檢測、食品安全監督等領域。
膠體金粒子對蛋白質具有較強吸附能力，可以與免疫球蛋白、毒素、酶、糖蛋白、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合。同時，膠體金顆粒具高電子密度特性，即金標物在相應配體處大量聚集，肉眼可見紅色或粉色斑點，因而，目前較多用于定性或半定量的快速免疫檢測方法。膠體金免疫層析試紙條以其簡便快速，成本低廉，結果直觀，檢測時間短，特異性強等優點，廣泛用于AFs、OTA、FBs、DON等真菌毒素檢測。并有商品化的試紙出售。
2.2.2 復合納米粒子(AgAu)標記免疫層析技術
金包銀納米粒子可放大特異性抗原抗體的反應信號，增強膠體金的顯色效果。Liao等制備了快速檢測AFB1的免疫層析試紙條。合成了AgAu復合納米顆粒并用于AFB1抗體的標記，和金納米顆粒標記抗體技術相比，試紙條靈敏度，重復性和穩定性都相應提高。其原理為利用復合納米粒子標記特異性抗體，檢測樣品液中特異性抗原，應用免疫層析技術制備、組裝成試紙條。所制備的試紙條的檢出限為0.1ng/mL，檢測時間為15min。該試紙條用于檢測大米、小麥、向日葵、棉花、辣椒和杏仁中AFB1，檢測結果與ELISA檢測結果一致。
2.3 磁珠免疫層析技術
磁珠免疫層析技術，它是將磁性納米材料(Magnetic nanoparticle，MNs) 的磁信號與免疫層析技術相結合的技術。磁納米探針通常由磁性元素(如Fe，Ni，Co)和它們的氧化物組成。該探針具有粒徑小、比表面積大，穿透性強、可快速移動及超順磁性、生物相容性、單分散性良好等特性，可在磁場下定位、富集和分離。此免疫標記物具有靈敏、快捷、高效、檢測范圍寬等優點，應用在免疫層析技術中使該技術向定量化、高靈敏度、多元化檢測、層析系統集成化等方向發展。
Tang等建立了一種快速檢測食物中黃曲霉毒素B2(AFB2) 的免疫層析檢測方法。AFB2單克隆抗體的免疫標記物為磁納米金微球(MnGMs)，這一微球以納米Fe2O3顆粒為核，金標納米顆粒為殼。將AFB2抗原和羊抗鼠IgG 分別噴涂于硝酸纖維素膜作為檢出限和質控線。結果表明，該試紙條檢出限為0.9ng/mL，相比金標免疫層析試紙條靈敏度提高3倍，并且15min內可得到定量檢測結果。
磁珠免疫層析技術是一項新興檢測技術，磁珠制備工藝及其敏感性，高特異結合等方面的進一步研究，將使該技術在毒素檢測中有更好的應用前景。