USP232/233與ICH Q3D在2018年1月1日開始全面實施了,面對新的標準比標準規定,小析姐為您步步拆解藥品中元素雜質分析方法驗證的工作流程，常見問題和挑戰。
對于法規指定的24種元素雜質，在風險評估 (Risk Assessment) 過程中，除了可以通過文獻查詢、供應商調查等非實驗手段來確認的低風險金屬元素雜質之外，還可以通過一定數量的篩查試驗，來評估其他相關元素雜質的潛在濃度水平。
監管機構的行業指南指出，根據具體的試驗目的(篩查試驗/常規實驗)，所有的試驗開展之前，都要先進行合理恰當的方法驗證。
今天就藥廠實驗室典型的元素雜質分析方法驗證流程，以及與常見的HPLC方法驗證的區別，分為幾部分為大家進行介紹。
第一步：確定要驗證的元素
在所有驗證工作開始之前，首先要明確需要測試的元素雜質。針對不同的給藥途徑，法規規定了對應的必須要評估的元素。其中1類，2A類的7種元素，是對所有產品都適用的。對于其他非強制/未主動添加的元素，藥廠可以根據其潛在的風險來決定是否要包括在方法驗證中。
對于這個問題，并沒有統一的答案。篩查所有的24種元素，很可能會帶來額外的工作量和成本，但在法規全面執行的初期也不失為一種穩妥的辦法。
元素雜質分類與每日限量
第二步：前處理方法
明確了要分析的金屬元素之后，就要確認方法驗證中最重要的部分-樣品前處理。好的方法驗證，從前處理開始。
與指導原則不同,USP<233>對于適用的四種前處理方法做出了明確的規定。需要強調的是，絕大多數的驗證數據偏差和后續方法開發的挑戰，都來自前處理的環節。
雖然每種方法都有自己的特點和適合的樣品類型(見下表)，總體來說直接溶解法在操作的簡易性與安全性，結果的穩定性上都具有一定的優勢，也是可以最先嘗試的步驟。
四種前處理方法的特點對比
比如對于有些易于直接溶解于有機溶劑(比如異丙醇, 二甲亞砜等等)中的醫藥中間體來說，由于避免了高溫高壓的反應過程，很多反應性，揮發性強的金屬雜質都能獲得不錯的回收，可以為后期的方法驗證以及最終的QC測試節約大量的工作量。
對于不能直接溶解的化合物，還可以選擇間接溶解法。其中密閉容器微波消解法是最主流的選擇，涉及的方法參數組合也比直接溶解要復雜些。
酸的選擇
一般來說，濃/稀硝酸(14M,7M或者2M)可以作為嘗試的起點。作為補充，適量的雙氧水也可以提供額外的氧化性，而不會產生干擾測試的離子。 當然也有很多硝酸無法消解的樣品，比如抗抑郁藥物卡馬西平，鹽酸阿米替林，鹽酸丙咪嗪，就會在微波消解的條件下和硝酸反應生成極穩定的產物。這時，您可以嘗試使用王水或者反王水的組合。
當然，如果選擇驗證全部24種元素的話，適當比例的鹽酸，可以在高溫消解的同時，穩定諸如汞(Hg)和鉑族元素(PGEs)等元素。對于某些特殊樣品，完全溶解可能會需要適量的氫氟酸(需要特殊的硬件)，而傳統的濕法消化中采用的高氯酸與硫酸，則很少在密閉消解和ICPMS平臺上采用。
樣品量
盡量小，除了原料成本的考慮之外(有些API確實很貴哦)，操作安全是很重要的因素。 濃酸氧化消解有機物的過程會瞬間產生大量的熱量和氣體，盡量選擇小樣品量對于樣品溶解和總體操作安全性會有很大幫助。
當然樣品量減小，會導致加標量和實際進樣濃度成比例的減小。這將對耗材(水/高純酸)的純度和儀器背景干擾的控制，提出更高的要求。
示例：一個對口服藥產品具有廣泛適用性的微波消解程序
第三步：預實驗
在摸索出完全溶解樣品的方法之后，簡單的預實驗可以幫助實驗室確認消解溶液的穩定性，儀器參數的設置準確度和精密度的大致范圍。為最終的完整方法驗證做好準備。
可能遇到的一些常見問題包括：
元素分析預實驗常見問題與原因
第四步：完整方法驗證
經過之前預實驗步驟，方法參數都已經確認，最后的方法驗證反而會是最直接的環節(見下表)。
定量方法驗證項目參數
最后需要強調的是，元素雜質實驗的系統適應性要求與傳統的液相方法是有區別的，其中：
· 系統適應性可以通過日常的調諧(daily tune)來實現;
· 質量分辨率(mass resolution)可以通過每月一次的質量調諧來實現;
· 對于痕量金屬分析來說，“重復5-6次進樣，RSD保持在NMT 2%”是很難實現的;
· ICPMS的線性范圍非常大，常規定量分析一般做0.5J與2J即可，不用做5個標準點。