鬼峰,顧名思義,就是指在相同的色譜條件下,有時候出現,有時候消失的雜峰。
鬼峰產生的原因是多種多樣的,查詢了相關文獻,結合本人以往的經驗,來談談鬼峰的成因及應對策略,主要體現在以下幾個方面:
1、流動相、樣品及儀器中存在雜質。運行梯度洗脫時,由于開始時有機相比例不高,洗脫能力不強,部分雜質在便富集在色譜柱頭處。隨著流動相中有機相比例的提高,洗脫能力不斷增強,一開始富集的雜質被洗脫下來,流出色譜柱而進入檢測器,從而形成鬼峰。
2、流動相脫氣不完全。當水和有機相在混合器中混合時,產生了氣泡。
3、操作問題。
針對以上原因,給出的對策如下:
原因1,主要有幾種情況:
1、試劑問題:
a)有機試劑:甲醇制備工藝相對乙腈來說較為簡單,雜質含量也較少。但是由于甲醇紫外吸收范圍比乙腈廣,所以當使用紫外檢測器時,尤其是波長較低時,盡量使用乙腈作為有機相,用甲醇的話漂移太大。而用作梯度色譜的乙腈質量要求較高,一般用進口梯度色譜專用乙腈能夠很好的減少鬼峰的出現。
b)水:很多單位用自制蒸餾水作為水相,但是結果并不是很好。原因就是一些低沸點的有機雜質并不能夠通過蒸餾除掉。有條件的盡量用HPLC級的純水,沒有條件的也可用娃哈哈或是屈臣氏等水代替,但是如果色譜條件比較嚴格也是有可能出問題的。
c)其它試劑:緩沖鹽、TFA、EDTA等試劑也會對流動相造成很大的影響,盡量用純度高的試劑配制流動相。
2、儀器問題:
a)液相的流動相管路被污染。長時間的使用含水量較高的流動相(尤其是加入緩沖鹽的,細菌就容易在管路中滋生,細菌的代謝產物或是細胞碎片能造成鬼峰。
b)輸送泵故障,造成系統壓力不穩,從而產生鬼峰。
c)單向閥堵塞,造成系統壓力不穩,從而產生鬼峰。
原因2,主要有以下幾種情況:
1、在線脫氣機脫氣不完全。
2、兩種流動相的有機相比例相差太大。例如A為100%水,B為100%乙腈。在梯度條件允許的情況下盡量減少兩中流動相之間的差距,降低空氣在兩中流動相中溶解度的差異,從而減少氣泡的產生。
3、流動相配置好后預先超聲脫氣。
原因3,主要有以下幾種情況:
1、流動相配置過程中受到污染:
a)盛放流動相的容器或是量具受到污染。這種污染可能來自于洗滌劑、鉻酸洗液或是其他實驗人員用完后的殘留雜質。流動相容器的清洗一般用干凈的水+有機溶劑涮洗就行,過多的清洗步驟反而可能造成二次污染。有時流動相容器的塑料蓋碎片都有可能是雜質的來源。
b) pH計。很多pH計以聚碳酸酯作為外殼,然而聚碳酸酯是可以溶于有機溶劑的,所以盡量使用玻璃pH計來測量流動相的pH。