由結核分枝桿菌（Mycobacterium
tuberculosis，MTB）
感染引起的結核病是當前導致發展中國家兒童死亡的重要疾病之一。近年來我國兒童結核病患病人數呈現出明顯的快速增長趨勢。2000
年第四次全國結核病流行病學調查數據顯示，14 歲以下兒童結核感染率為 9%。由于兒童自身免疫力較弱，感染 MTB
后極易迅速發展為嚴重的活動性結核病。然而， 目前我國兒童結核病的診治工作卻面臨著臨床快速診斷困難、MTB
耐藥、非結核分枝桿菌（NTM）感染增多等一系列難題。因此，建立快速準確的新型實驗室診斷體系，
開展兒童結核病感染菌株病原體鑒定、耐藥性監測以及加強結核病患兒的早期診斷勢在必行。
近年來，
隨著分子生物學和免疫學技術的快速發展，以全自動聚合酶鏈反應（PCR）技術為基礎，同時檢測 MTB 和利福平（rifampicin，
RIF）耐藥的分子生物學檢測方法——Xpert MTB/RIF 試驗和以酶聯免疫試驗為基礎，檢測 MTB 特異性的宿主 T
淋巴細胞的免疫學方法——干擾素 -γ 釋放試驗（interferongamma release assays，
IGRAs），作為結核病快速診斷的新方法應運而生， 為兒童結核病診斷提供了新思路。本文將對上述兩種實驗室診斷新方法及其在臨床的應用進行介紹。
一、Xpert MTB/RIF 試驗
1.
試驗原理：Xpert MTB/RIF 試驗作為一種全自動核酸擴增技術，以半巢式熒光定量 PCR 技術為基礎， 以 MTB
對利福平耐藥的相關基因 ropB 為靶基因，根據其 81bp 的核心區設計 5 條相互重疊的探針，同時根據球芽胞桿菌（Bacillus
globigii）基因組設計 1 條內參探針， 使用六重定量 PCR 對痰液中的 MTB 進行檢測。該方法操作簡單，2 h 內即可讀取檢測結果。
ropB
基因是利福平耐藥的相關基因，95% 以上的利福平耐藥菌株存在 ropB
基因突變，同時幾乎所有利福平敏感菌株在該區域具有相同核酸序列，這一現象也說明 ropB
基因具有鑒定利福平耐藥菌株的能力。此外，由于大部分利福平耐藥菌株同時對異煙肼耐藥， 故利福平耐藥情況在一定程度上可以作為耐多藥結核病的監測指標。
2.
結果判定：MTB 檢測結果是按照熒光定量 PCR 中探針 Ct 值的大小進行判讀的。球芽胞桿菌特異性探針的 Ct 值≤38 時，
則認為質控指標為陽性；反之，則結果記為無效，代表處理的標本的 DNA 提取不合格或者含有 PCR 抑制物。5 個探針中至少 2 個探針的 Ct
值≤38 時， 即認為檢測到標本中含有 MTB。利福平耐藥的檢測基礎在于 MTB 特異分子信標早期 Ct 值和晚期 Ct 值的差異，即ΔCt
值。系統設置的結果判斷標準是ΔCt＞3.5， 代表對利福平耐藥，ΔCt≤3.5 循環數，代表對利福平敏感。
3.
診斷價值： 由于結核病患兒體液標本的細菌載量低，病原學培養陽性率及痰涂片陽性率低。因此 Xpert MTB/RIF 試驗作為 MTB
檢測的新方法， 其臨床指導意義尤為重要。由于該試驗為 2010
年世界衛生組織（WHO）推薦使用的結核病診斷新方法，其在兒童結核病領域的研究才剛剛起步。在已發表的文獻中，共計有 10 篇關于 Xpert
MTB/RIF 在成人結核病診斷中的獨立研究。對患者呼吸道標本的研究發現，Xpert MTB/RIF 試驗在痰涂片陽性結核病中的敏感度為
98%~100%，痰涂片陰性結核病中的敏感度為 57%~83%。Mooure 等對 Xpert MTB/RIF 試驗的影響因素進行了分析，
結果顯示， 臨床標本 MTB 含量越高，Xpert MTB/RIF 試驗結果陽性率越高； 標本凍存時間長短對 Xpert MTB/RIF
試驗結果影響不明顯。有研究評估了 Xpert MTB/RIF
在非呼吸道標本中（腦脊液、胃液、組織、胸水、尿液、糞便）診斷結核病的價值。結果顯示，以臨床綜合診斷結果為肺外結核病的診斷金標準時，Xpert
MTB/RIF 試驗的敏感度較高，為 77.3%~95.0%（另有 1 篇文獻報道的敏感度僅為 53%， 其樣本量較小， 僅 32
份標本）；特異度達到 98.2%~100.0%。
在兒童結核病診斷方面，
僅南非學者對 XpertMTB/RIF 試驗和傳統的痰涂片方法檢測 MTB 的準確性進行了比較研究。該研究納入了 452 例 15
歲以下的疑似結核病患兒，以其誘導痰液的 MTB 培養結果為金標準，通過對兩次誘導痰液標本進行檢測，發現 Xpert MTB/RIF
試驗的陽性率為 75.9%， 而痰涂片的陽性率為 37.9% ； 痰涂片陽性者其 XpertMTB/RIF 結果也均為陽性， 痰涂片陰性者中仍有
58.1% 為 Xpert MTB/RIF 陽性；痰涂片陰性者進行兩次重復試驗較單次檢測的敏感度顯著提高（61.0%vs.
33.3%）。由此可見，在對疑似結核病患兒進行初篩時，因 Xpert MTB/RIF
試驗具有較高的敏感度，可作為痰涂片的替代方法。在臨床實際應用中，應至少對標本重復檢測兩次以提高敏感度。
4.
應用前景及局限性：Xpert MTB/RIF 操作簡便快速，
可為兒童結核病快速早期診斷提供及時的數據。該試驗對呼吸道標本檢測的敏感度高，可作為痰涂片檢測的有效替代方法；
也可用于非呼吸道標本的檢測，包括腦脊液、胃液、組織、胸水、尿液、糞便等，因此對肺外結核病的診斷價值較高；同時還能檢測利福平耐藥情況。然而，由于該方法的硬件要求較高，檢測成本高，從而阻礙了其在結核病高發的發展中國家的推廣。
總之，Xpert MTB/RIF 試驗以其獨特的優點正逐漸成為全球診斷結核病的重要手段。伴隨著經濟和社會的發展和實驗平臺的完善，Xpert MTB/RIF 方法將在更多的領域得到應用。
二、干擾素 -γ 釋放試驗
1. 試驗原理： 干擾素 -γ 主要由 MTB 抗原活化的效應 T 淋巴細胞產生，包括 CD4+ 和 CD8+T
淋巴細胞。MTB 感染者的效應 T 淋巴細胞，在受到 MTB 特異抗原早期分泌靶蛋白 ESAT-6(early-secreted
antigenictarget-6) 和培養濾液蛋白 CFP-10(culture filtrateprotein-10) 刺激后可分泌干擾素
-γ。研究者通過酶聯免疫斑點試驗（ELISPOT）或者酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的方法對所分泌的干擾素 -γ
進行定量檢測，從而判斷機體內是否存在對 MTB 反應的效應 T 細胞，對 MTB 感染進行輔助診斷。
ESAT-6
和 CFP-10 是由 MTB 基因組 RD1 區編碼的低分子量蛋白。而 RD1
基因為卡介苗（BCG）菌株在體外傳代期間缺失的基因組片斷，因此 ESAT-6 和 CFP-10 蛋白只存在于 MTB
復合群中，在卡介苗菌株和大部分環境分枝桿菌中缺乏， 理論上能區分卡介苗或 MTB 自然感染所致的結核菌素（PPD）試驗陽性結果。
2.
結果判定：目前干擾素 -γ 釋放試驗成熟的商品化試劑盒產品主要為 T-SPOT-TB（T-SPOT）試劑盒和 QuantiFERON-TB
Gold In-Tube （QFT-GIT）試劑盒，兩種試劑盒分別根據 ELISPOT 和 ELISA 的原理而設計。
T-SPOT-TB
試劑盒的結果根據斑點數進行判讀，1 個斑點代表 1 個分泌干擾素 -γ 的效應 T
細胞。陰性孔和陽性孔為質控作用，如陰性孔斑點數﹥10，說明可能存在細菌污染，如陽性孔斑點數﹤20，說明可能存在細胞數量或活力不足。出現這兩種結果可根據具體情況判斷。如陰性對照斑點數為
0～5 個，任何 1 個檢測孔計數減去陰性孔計數≥6 判定為陽性；如陰性對照斑點數≥6，檢測孔斑點數≥2 倍陰性對照孔斑點數，也判定為陽性。
QuantiFERON-TB
Gold In-Tube 試劑盒的結果根據各孔干擾素 -γ 濃度值進行判讀。檢測孔干擾素 -γ 濃度減去陰性孔干擾素 -γ 濃度≥0.35
IU/ml，且干擾素 -γ 濃度≥25% 陰性孔判定為陽性。檢測孔干擾素 -γ 濃度減去陰性孔干擾素 -γ 濃度≥0.35IU/ml， 但干擾素
-γ 濃度＜25% 陰性孔或檢測孔干擾素 -γ 濃度減去陰性孔干擾素 -γ 濃度＜0.35 IU/ml 判定為陰性。
陽性結果提示測試樣本中含有針對
MTB 特異的效應 T 淋巴細胞，患者存在結核感染。但是否為活動性結核病，
則需要結合臨床癥狀及其他檢測指標綜合判斷。陰性結果提示測試樣本中不含有針對 MTB 特異的效應 T
淋巴細胞。但如存在以下情況：①少數被檢測者存在免疫系統功能不全或免疫系統疾病時，②實驗非正常操作引起的差異等，陰性結果并不能排除結核感染的可能。
3.
診斷價值：PPD 試驗作為傳統的兒童結核病免疫學檢測方法， 仍是當前結核病診斷的重要指標之一。然而，該方法卻存在著以下幾個缺點：①PPD
試驗所用的抗原為成分不明確的復合抗原， 其中大多數為卡介苗菌株和分枝桿菌共同的抗原， 可引起機體遲發型變態反應而導致假陽性結果；
②在免疫抑制者、新近感染者、營養不良者以及幼兒中，PPD 試驗會出現假陰性結果，導致其敏感度降低。因此，干擾素 -γ
釋放試驗以其較高的敏感度和特異度逐漸得到了廣泛應用。
在已發表的文獻中，
共有 16 篇關于干擾素 -γ釋放試驗對兒童結核病診斷的獨立研究。一項 META 分析顯示，干擾素 -γ 釋放試驗在結核病患兒中診斷的敏感度與
PPD 試驗相似，為 85%；而在健康兒童中篩查潛伏結核感染者時， 由于其不受卡介苗接種的影響， 顯示出了較高的特異度
(90%~100%)，遠高于 PPD 試驗（56%）。國外學者 Chun 等對 71 例接種過卡介苗的兒童研究發現， 其 PPD
試驗的陽性率明顯高于干擾素 -γ 釋放試驗，提示 PPD 試驗受卡介苗接種的影響，其特異性低；另一項研究顯示， 由于 NTM 的影響，PPD
試驗的特異度只有 22%， 而干擾素 -γ 釋放試驗的特異度高于 PPD 試驗。同樣 Detjen 等也證實了這一結論。
另外，
還有研究在結核病接觸兒童中以接觸者暴露程度的等級作為金標準，對干擾素 -γ 釋放試驗的應用價值進行了評價，發現干擾素 -γ
釋放試驗陽性率與近期結核病密切接觸史的相關性明顯高于 PPD 試驗。Ewer 等發現干擾素 -γ 釋放試驗和 PPD 試驗一致性較好（κ =
0.72），而前者與結核感染暴露程度相關性更高。上述結果提示，在有結核病接觸史的人群中進行干擾素 -γ
釋放試驗篩查結核感染者具有很好的指導價值。
4.
應用前景及局限性：干擾素 -γ
釋放試驗的優點在于：①不受卡介苗接種的影響，因此被美國疾病預防控制中心（CDC）推薦作為卡介苗接種兒童結核感染檢測的首選；②不受 NTM
和其他細菌感染的影響，可用于結核病的鑒別診斷，如呼吸系統疾病與結核病的鑒別診斷、不明原因發熱患兒結核感染排查、克羅恩病和腸結核的鑒別診斷等；
③受機體免疫學狀態的影響較小， 也可以用于艾滋病 /
結核病（HIV/TB）雙重感染人群的檢測、免疫抑制劑治療前后的篩查、大劑量激素治療前后的篩查等；④其他優于 PPD 試驗的方面，
如檢測過程短，24 h 即可得結果；不需要患者重返醫院進行結果讀取；結果讀取避免了一定的主觀性等。
干擾素
-γ 釋放試驗檢測以 T 細胞介導的免疫應答，在結核感染早期、機體內細菌載量較低時就可靈敏地檢測到效應 T 細胞分泌的干擾素
-γ，從而顯示陽性結果， 但該試驗無法區分潛伏結核感染和活動性結核病。另外， 由于該試驗對操作技術要求較高、成本較高，因此可以作為 PPD
試驗初篩后的補充方法， 輔助臨床醫師排除 PPD 試驗的假陽性結果。
干擾素
-γ 釋放試驗以其較高的敏感度和特異度正逐漸成為當前結核病診斷的重要手段，
并已被廣泛應用于：①兒童結核病的輔助診斷，如痰培養陰性或者涂片陰性結核病患兒的輔助診斷、肺外結核病的鑒別診斷、抗結核病治療的療效評估等；②兒童結核感染的篩查，
如使用免疫抑制劑治療、HIV 感染、糖尿病、血液病等患兒的篩查；③結核病接觸兒童感染風險的評估等。總之，干擾素 -γ
釋放試驗將在兒童結核病診斷中發揮越來越重要的作用。