1.ACTH1-24興奮試驗
對于經典型21-羥化酶缺陷癥患者，根據臨床表現和基礎17-OHP（17-羥孕酮），一般可以明確診斷。血清17-OHP基礎值不能提供足夠的診斷依據時，有必要進行ACTH(促腎上腺皮質激素)1-24興奮試驗。一般而言60分鐘時17-OHP水平在10ng/ml以上考慮非經典型21羥化酶缺陷癥的診斷。每個實驗室都應根據21羥化酶缺陷癥雜合子攜帶者和正常人確定出自己的診斷標準。
2.失鹽的檢查
PRA（血漿腎素活性）值升高，特別是PRA與24小時尿醛固酮比值增加標志著醛固酮合成障礙。在循環血中ACTH，17-0HP和孕酮水平高，但醛固酮水平正常的病例中這些指標也會升高，這樣沒有很好控制的單純男性化患者的生化表現會與失鹽型混淆。鹽皮質激素治療可以抑制這些患者的腎上腺，有助于二者的鑒別。理想狀態下，血漿和尿醛固酮水平應該與PRA和鈉平衡相關，從而有助于對臨床類型的準確判斷。在分析腎素水平的意義時，必須注意新生兒正常值高于年齡較大的兒童。
3.性染色體檢查
女性細胞核染色質為陽性，男性則為陰性，女性染色體計數性染色體為XX，男性則為XY,可確定其真正性別。
4.B型超聲檢查
先天性腎上腺皮質增生女性假兩性畸形的內生殖器正常，B超和經插管X線造影能顯示子宮和輸卵管。B超、CT、MRI有助于鑒別腎上腺增生或腫瘤，先天性增生為雙側腎上腺對等增大，而腫瘤多為單側孤立腫塊，可有鈣化，因出血和壞死可形成液化腔。
5.其他
女性腎上腺皮質增生假兩性畸形者，用尿道鏡檢查尿生殖竇，可見陰道開口于子宮頸，若家族中有21-羥化酶缺乏者，可采用聚合酶鏈式反應（PCR）、羊膜細胞HLA分型和DNA進行分析。