直到18世紀中期，人們一直以為植物體內的全部營養物質，都是從土壤中獲得的，并不認為植物體能夠從空氣中得到什么。1771年，英國科學家普利斯特里發現，將點燃的蠟燭與綠色植物一起放在一個密閉的玻璃罩內，蠟燭不容易熄滅；將小鼠與綠色植物一起放在玻璃罩內，小鼠也不容易窒息而死。因此，他指出植物可以更新空氣。但是，他并不知道植物更新了空氣中的哪種成分，也沒有發現光在這個過程中所起的關鍵作用。后來，經過許多科學家的實驗，才逐漸發現光合作用的場所、條件、原料和產物。
1864年，德國科學家薩克斯做了這樣一個實驗：把綠色葉片放在暗處幾小時，目的是讓葉片中的營養物質消耗掉。然后把這個葉片一半曝光，另一半遮光。過一段時間后，用碘蒸氣處理葉片，發現遮光的那一半葉片沒有發生顏色變化，曝光的那一半葉片則呈深藍色。這一實驗成功地證明了綠色葉片在光合作用中產生了淀粉。
1880年，德國科學家恩吉爾曼用水綿進行了光合作用的實驗：把載有水綿和好氧細菌的臨時裝片放在沒有空氣并且是黑暗的環境里，然后用極細的光束照射水綿。通過顯微鏡觀察發現，好氧細菌只集中在葉綠體被光束照射到的部位附近；如果上述臨時裝片完全暴露在光下，好氧細菌則集中在葉綠體所有受光部位的周圍。恩吉爾曼的實驗證明：氧是由葉綠體釋放出來的，葉綠體是綠色植物進行光合作用的場所。