光學顯微鏡的使用及示教片的觀察

一、實驗目的 1. 學習并掌握油鏡的原理和使用方法。 2. 復習普通臺式顯微鏡的結構、各部分的功能和使用方法。 二、顯微鏡的基本結構及油鏡的工作原理 現代普通光學顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統來放大成像，故又常 被稱為復式顯微鏡。它們由機械裝置和光學系統兩大部分組成。在顯微鏡的光學系統中，物鏡的性能最為關鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學顯微鏡通常配置的幾種物鏡中，油鏡的放大倍數最大，對微生物  學研究最為重要。與其他物鏡相比，油鏡的使用比較特殊，需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，這主要有如下二方面的原因： 1. 增加照明亮度 油鏡的放大倍數可達 100 Χ，放大倍數這樣大的鏡頭，焦距很短，直徑很小，但所需要的光照強度卻最大。從承載標本的玻片透過來的光線，因介質密度不同（從玻片進入空氣，再進入鏡頭），有些光線會因折射或全反射，不能進入鏡頭，致使在使用油鏡時會因射入的光線較少，物像顯現不清。所以為了不使通過的光線有所損失，在使用油鏡時須在油鏡與玻片之間加入與玻璃的折射率（ n=1.55 ）相仿的油鏡（通常用香柏油，其折射率 n=1.52）。 2. 增加顯微鏡的分辨率 顯微鏡的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指顯微鏡能辨別兩點之間的最小距離的能力。從物理學角度看，光學顯微鏡的分辨率受光的干涉現象及所用物鏡性能的限制，分辨力D可表示為：D=λ/2N.A，式中λ= 光波波長； NA= 物鏡的數值孔徑值。 光學顯微鏡的光源不可能超出可見光的波長范圍（ 0.4--0.7 μ m ），而數值孔徑值則取決于物鏡的鏡口角和玻片與鏡頭間介質的折射率，可表示為：NA=n × sin α式中α為光線最大入射角的半數。它取決于物鏡的直徑和焦距，一般來說在實際應用中最大只能達到 120 O ，而 n 為介質折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空氣及水的折射率（分別為 1.0 和 1.33 ）要高，因此以香柏油作為鏡頭于玻片之間介質的油鏡所能達到的數值孔徑值（NA 一般在1.2-1.4）要高于低倍鏡、高倍鏡等干鏡（ NA 都低于 1.0）。若以可見光的平均波長 0.55 μm來計算，數值孔徑通常在0.65左右的高倍鏡只能分辨出距離不小于0.4μm的物體，而油鏡的分辨率卻可達到 0.2 μ m 左右。三、實驗器材 1. 菌種：枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis ）染色玻片標本。青霉（Penicillium sp.）的水封片等（教師可根據具體情況選用菌種）。 2. 溶液或試劑：香柏油、乙醇：乙醚混合液 3. 儀器或其他用具：顯微鏡、擦鏡紙等。 四、操作步驟 1. 觀察前的準備 （1） 顯微鏡的安置：置顯微鏡于平整的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊緣約3-4cm 。鏡檢時姿勢要端正。 取放顯微鏡時應一手握住鏡臂，一手托住底座，使顯微鏡保持直立、平穩。切忌用單手拎提；且不論使用單筒顯微鏡或雙筒顯微鏡均應雙眼同時睜開觀察，以減少眼睛疲勞，也便于邊觀察邊繪圖或記錄。 （2） 光源調節：安裝在鏡座內的光源燈可通過調節電壓以獲得適當的照明亮度，而使用反光鏡采集自然光或燈光作為照明光源時，應根據光源的強度及所用物鏡的放大倍數選用凹面或凸面反光鏡并調節其角度，使視野內的光線均勻，亮度適宜。 （3）根據使用者的個人情況，調節雙筒顯微鏡的目鏡，雙筒顯微鏡的目鏡間距可以適當調節，而左目鏡上一般還配有曲光度調節環，可以適應眼距不同或兩眼視力有差異的不同觀察者。 （4） 聚光器數值孔徑值的調節：調節聚光器虹彩光圈值與物鏡的數值孔徑值相符或略低。有些顯微鏡的聚光器只標有最大數值孔徑值，而沒有具體的光圈數刻度。使用這種顯微鏡時可在樣品聚焦后取下一目鏡，從鏡筒中一邊看著視野，一邊縮放光圈，調整光圈的邊緣與物鏡邊緣黑圈相切或略小于其邊緣。因為各物鏡的數值孔徑值不同，所以每轉換一次物鏡都應進行這種調節。 在聚光器的數值孔徑值確定后，若需改變光照強度，可通過升降聚光器或改變光源的亮度來實現，原則上不應再通過虹彩光圈的調節。當然，有關虹彩光圈、聚光器高度及照明光源強度的使用原則也不是固定不變的，只要能獲得良好的觀察效果，有時也可根據不同的具體情況靈活運用，不一定拘泥不變。 2. 顯微觀察 在目鏡保持不變的情況下，使用不同放大倍數的物鏡所能達到的分辨率及放大率都是不同的。一般情況下，特別是初學者，進行顯微觀察時應遵守從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的觀察程序，因為低倍數物鏡視野相對大，易發現目標及確定檢查的位置。 （1） 低倍鏡觀察 金黃色葡萄球菌染色標本玻片置于載物臺上，用標本夾夾住，移動推進器使觀察對象處在物鏡的正下方。下降 10 Χ物鏡，使其接近標本，用粗調節器慢慢升起鏡筒，使標本在視野中初步聚焦，再使用細調節器調節圖象清晰。通過玻片夾推進器慢慢移動玻片，認真觀察標本各部位，找到合適的目的物，仔細觀察并記錄所觀察到的結果。 在任何時候使用粗調節器聚焦物像時，必需養成先從側面注視小心調節物鏡*近標本，然后用目鏡觀察，慢慢調節物鏡離開標本進行準焦的習慣，以免因一時的誤操作而損壞鏡頭及玻片。 （2） 高倍鏡觀察 低倍鏡下找到合適的觀察目標并將其移至視野中心后，輕輕轉動物鏡轉換器將高倍鏡移至工作位置。對聚光器光圈及視野亮度進行適當調節后微調細調節器使物像清晰，利用推進器移動標本仔細觀察并記錄所觀察到的結果。 在一般情況下，當物像在一種物鏡中已清晰聚焦后，轉動物鏡轉換器將其他物鏡轉到工作位置進行觀察時，物像將保持基本準焦的狀態，這種現象稱為物鏡的同焦 (parfocal) 。利用這種同焦現象，可以保證在使用高倍鏡或油鏡等放大倍數高、工作距離短的物鏡時僅用細調節器即可對物像清晰聚焦，從而避免由于使用粗調節器時可能的誤操作而損壞鏡頭或載玻片。 （3） 油鏡觀察 高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的樣品區域后，用粗調節器將鏡筒升高，然后將油鏡轉到工作位置。在待觀察的樣品區域加滴香柏油，從側面注視，用粗調節器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標本相接。將聚光器升至最高位置并開足光圈，若所用聚光器的數值孔徑值超過 1.0 ，還應在聚光鏡與載玻片之間也加滴香柏油，保證其達到最大的效能。調節照明使視野亮度合適，用粗調節器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現物像并用細調節器使其清晰準焦為止。 有時按上述操作還找不到目的物，則可能是由于油鏡頭下降還未到位，或因油鏡上升太快，以至眼睛捕捉不到一閃而過的物像。遇此情況，應重新操作。另外應特別注意不要因在下降鏡頭時用力過猛，或調焦時誤將粗調節器向反方向轉動而損壞鏡頭及載玻片。 3. 顯微鏡用畢后的處理 （1） 上升鏡筒，取下載玻片。 （2） 用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。 （3） 用擦鏡紙清潔其他物鏡及目鏡；用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。 （4） 將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將物鏡轉成“八”字形，再向下旋。同時把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發生碰撞危險。 五、實驗報告 1.分別繪出你在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌及青霉的形態，包括在三種情況下視野中的變化。同時注明物鏡放大倍數和總放大率。 六、思考題 1、用油鏡觀察時應注意哪些問題？在載玻片和鏡頭之間加滴什么油？起什么作用？ 2、試列表比較低倍鏡、高倍鏡及油鏡各方面的差異。為什么在使用高倍鏡及油鏡時應特別注意避免粗調節器的誤操作？ 3、什么是物鏡的同焦現象？它在顯微鏡觀察中有什么意義？ 4、影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？ 5、根據你的實驗體會，談談應如何根據所觀察微生物的大小，選擇不同的物鏡進行有效的觀察。