試劑、試劑盒 溶液與緩沖液LoTEcDNA標簽連接酶
儀器、耗材 試劑盒PCR儀
實驗步驟
一、在pZero的I位點連接串聯體
1.SphI酶切載體，與按大小回收的串聯體片段連接；我們推薦在pZero的Sph1位點上克隆串聯體，有關于在此載體上克隆的細節我們參考了Zero Background 克隆試劑盒的使用手冊：
2.在16℃ 下孵育過夜。
3.以LoTE擴增體積到200ul。
4.等體積的PCI進行抽提（實驗方案A, 第2步)。
5.入下列物質沉淀水相：
6.4°C 下，在微離心機中以13000r/min離心15 min。
7.沖洗沉淀物4次（！！！），然后瞭干。
8.重懸于4ul 的 LoTE中。
9.用1ul連接混合物來轉化ELECTROMAXDHlOB 細胞。
二、電穿孔
可應用任何轉化方法，我們推薦使用電穿孔法是由于它與感受態ELECrR0MAXDHlOB 細胞結合轉化效率很高（>1010 轉化體/ug 質粒)。
1.在冰上融化 100ul的 ELECTROMAX DH10B細胞。
2.同時在冰上冷卻所需數量的電穿孔小杯。
3.融化后，立即對 ELECTROMAXDH10B細胞進行下一步操作，將其分為每份 35ul（冰上操作)。
4.向 35ul—份的細胞中加入 ImI 的連接產物，輕叩試管使其混合。
5.移入冷卻好了的小杯中，將細胞移至小杯的電極間，然后保存于冰上。
6.用下述設置在 GenePulserD 上電穿孔：
7.應用這個脈沖后，立即加入 965ulSOC 介質。
8.在 37°C下孵育 Ih。
9.含有抗生素 Zeocin 的LB 板上用 50ul 或 IOOul 鋪板。
注意：有關板和 SOC 介質的詳細情況在 ZeroBackground克隆試劑盒的使用手冊中有詳盡描述。
10.37°C 的恒溫箱內將鋪好的板過夜孵育。
11.第二天這些板上應含有數百個克隆。
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