由 Taq DNA 聚合酶 PCR 擴增產生的帶 3' 突出端為 A 堿基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 載體上，這種 T 載體有與 A 堿基互補的未配對 3' T 堿基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 由 Taq DNA 聚合酶 PCR 擴增產生的帶 3' 突出端為 A 堿基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 載體上，這種 T 載體有與 A 堿基互補的未配對 3' T 堿基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。 |
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| 實驗材料 | 噬菌體 T4 DNA 連接酶PCR 擴增的靶 DNAT 載體 |
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| 儀器、耗材 | 瓊脂糖凝膠水浴箱 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 酶與緩沖液
噬菌體 T4 DNA 連接酶
2. 凝膠
瓊脂糖凝膠
3. 核苷酸與寡核苷酸
PCR 擴增的靶 DNA ( 25 μg/ml)
4. 載體
T 載體
5. 特殊設備
預設水溫在 14℃ 的水浴箱
二、方法
1. 在一只微量離心管內，依次加入下列連接混合液：
25 μg/ml 擴增靶序列 DNA 1 μl
T 質粒 20 ng
10X 連接緩沖液 1 μl
噬菌體 T4 DNA 連接酶 3 單位
H2O 補足至 10 μl
2. 將連接混合液在 14℃ 溫育 4 h。
3. 將上述兩支試管內的連接反應混合液樣品各取 5 μl，用 10 μl H2O 稀釋后，轉化具有抗生素抗性的感受態大腸桿菌受體菌。將這種轉化菌液涂布在含有合適抗生素和 IPTG 與 X-gal 的培養基的平皿上。
4. 計算實驗組與對照組在培養皿上的菌落數。挑取可能含有靶基因 DNA 插入片段的白色菌落進行培養擴增，抽提質粒 DNA，利用質粒多克隆位點內的插入外源 DNA 片段側翼的酶切位點，用相應的限制性內切核酸酶進行酶切鑒定；也可以直接用菌落 PCR 予以鑒定。
5. 通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定克隆 DNA 片段的大小（采用合適的 DNA marker分子量作對照）。
6. 利用 DNA 序列分析，限制性內切核酸酶圖譜或 Southern 雜交進一步鑒定克隆的靶基因 DNA 片段的正確性。 |
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