適用于測定牛奶、奶粉，以及低脂牛奶、脫脂牛奶、低脂奶粉和脫脂奶粉中黃曲霉毒素 M1 的含量。奶粉中的最低檢測限是0.08μg/kg，牛奶中的最低檢測限是0.008μg/kg。
2、原理
試樣通過免疫親和柱時，黃曲霉毒素 M1 被提取。親和柱含有特性的抗體鍵合在固體支持物上。當樣品通過親和柱時，抗體選擇性地與所有存在的黃曲霉毒素 M1（抗原）鍵合，形成抗體抗原復合體。停留在親和柱上的所有樣品上其他雜質用水清洗掉。然后用淋洗液將親和柱上的黃曲霉毒素 M1 洗脫下來，收集洗脫液。用帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀（HPLC）測定洗脫液中黃曲霉毒素 M1 含量。
3、試劑
除非特別聲明，所用試劑為分析純，使用蒸餾水、軟化水或其他相當純度的水。
（1）免疫親和柱
免疫親和柱應該含有黃曲霉毒素 M1 的抗體。親和柱的最大容量不小于100ng 黃曲霉毒素 M1（相當于50mL 濃度為2μg/L 的試樣）、當標準溶液含有4ng 黃曲霉毒素 M1（相當于50mL 濃度為80ng/L 的試樣）時回收率不低于80％。應該經常檢查親和柱的技術性能，對于每個批次的親和柱至少檢查一次。
a.柱效檢查 用移液管移取1.0mL 的黃曲霉毒素 M1 儲備液到20mL 的錐形試管中。用恒流的氮氣將液體慢慢吹干，然后用10mL10％的乙腈溶解干基質，用力搖蕩。
將該溶液加入到40mL 的水中，充分混勻，全部通過免疫親和柱。按要求使用親和柱。淋洗親和柱，洗脫下黃曲霉毒素 M1，將洗脫液進行適當稀釋后，用 HPLC 測定親和柱鍵合的黃曲霉毒素 M1 的含量。
計算黃曲霉毒素 M1 的回收率，將其結果與中所要求的指標進行對比。
b.回收率檢查 用移液管移取0.8mL 0.005μg/mL 的黃曲霉毒素 M1 標準工作液到10mL 的水中，充分混勻，全部通過免疫親和柱。按要求使用親和柱。淋洗親和柱，洗脫下黃曲霉毒素 M1，將洗脫液進行適當稀釋后，用 HPLC 測定親和柱鍵合的黃曲霉毒素 M1的含量。計算黃曲霉毒素 M1 的回收率，將其結果與①中所要求的指標進行對比。
（2）乙腈：色譜級。
a.乙腈水溶液（25％，V/V），將250mL 的乙腈與750mL 的水（使用前需要脫氣）混溶。
b.10％的乙腈水溶液（V/V），將100mL 的乙腈與900mL 的水（使用前需要脫氣）混溶。
（3）氮氣。
（4）氯仿：
加入0.5％～1.0％（m/m）的乙醇中進行穩定化。
（5）黃曲霉毒素 M1 標準溶液。
a.標準溶液 黃曲霉毒素 M1 標準溶液濃度為10μg/mL。根據下面的方法，在最大吸收波段處測定溶液的吸光度，以確定黃曲霉毒素 M1 的實際濃度。
用分光光度計，在340～370nm 處測定扣除氯仿的空白本底，讀取標準溶液的吸光度值。在最大吸收波段處，（λmax＝360nm）測得吸光度值為 A，根據下列公式計算出濃度值c1（μg/mL）：
式中A——在 λmax 處測得的吸光度值。
M——328g/mol，黃曲霉毒素M1摩爾質量，g/mol；
m——1995m2/mol，溶于氯仿中的黃曲霉毒素 M1 的吸光系數，m2/mol。
b.標準儲備液 確定標準溶液的實際濃度值后（⑤a.），繼續用氯仿將其稀釋至濃度為0.1μg/mL 的儲備液。儲備液應蓋好蓋，用鋁箔包裝好避光保存。
將儲備液放在冰箱中5℃以下保存。在這種情況下，儲備液可以穩定2個月。2個月后，應該對儲備液的穩定性進行核查。
c.黃曲霉毒素 M1 標準工作液 從冰箱中取出儲備液（⑤b.）放置至室溫，然后移取一定量的儲備液進行稀釋制備成工作液。工作液當日使用當天制備。
黃曲霉毒素 M1 標準工作液配制：用移液管準確移取1.0mL 的儲備液到20mL 的錐形試管中，用恒流的氮氣將液體慢慢吹干，然后用20.0mL 10％的乙腈將干基質重新溶解，在30min 內經常振搖、充分混勻，配成濃度為0.005μg/mL 的黃曲霉毒素 M1 標準工作液。在用氮氣對儲備液吹干的過程中，一定要仔細操作，不能讓溫度降得太低，防止凝聚產生。
在做標準曲線時，注入 HPLC 的黃曲霉毒素 M1 量分別為0.05ng，0.1ng，0.2ng和0.4ng.根據 HPLC 進樣量，用工作液可以配制一系列適當濃度的黃曲霉毒素 M1 標準溶液，稀釋液用10％的乙腈。
4、儀器設備
使用實驗室通用儀器設備，特殊情況說明如下。
①一次性注射器：10mL和50mL。
②真空系統。
③離心機：離心力4000g。
④移液管：1.0mL，2.0mL和50.0mL。
⑤玻璃燒杯：250mL。
⑥容量瓶：100mL。
⑦水浴：能在30℃±2℃，50℃±2℃，35～37℃之間溫度段使用。
⑧濾紙。
⑨有刻度的錐形玻璃試管：帶玻璃磨口的瓶頸和瓶塞，容量為5mL，10mL，20mL。
⑩高效液相色譜儀。
a.無脈沖泵：可以調節到恒體積流量為1mL/min。
b.進樣系統：具有固定進樣量，進樣體積從50μL至500μL。
c.反相色譜柱：填充3μm 或者5μm 的十八烷基硅膠，加填充有反相材料的保護柱。
d.熒光檢測器：能夠產生365nm 的激發波長、435nm 的發射波長，在適當的色譜條件下能夠測定0.02ng 的黃曲霉毒素 M1（相當于5倍噪音）。
e.記錄儀：帶打印機或標繪器、或者電子積分儀、或者計算機數據處理系統。
①分光光度計：波長范圍為200～400nm，帶1cm 的石英比色池。
天平：能夠稱量到0.1g，可讀至0.01g。
5、采樣
實驗室收到的樣品應該具有真正的代表性，在運輸的過程中沒有被損壞和變性。
6、分析步驟
（1）概述 所有的操作分析均應盡可能地在避光條件下進行。
對于用奶粉沖制的牛奶，使其通過免疫親和柱，然后清洗、淋洗親和柱。親和柱的制造商規定的操作方法稍有差異，分析人員應該嚴格地按照說明書進行分析操作。通常的分析步驟包括：用水或者鹽水緩沖液將奶粉沖制成牛奶，離心分離后在一定壓力的作用下使牛奶樣品通過親和柱（可能需要預清洗）、用水清洗親和柱、用甲醇或乙腈將黃曲霉毒素M1從親和柱上洗脫下來。在操作過程中，特別要注意各種液體通過親和柱的流速。
（2）試樣制備
a.牛奶將牛奶樣品在水浴中加熱到35～37℃。用濾紙過濾（根據情況，也許需要用幾種不同規格的濾紙進行過濾），或者在4000g下離心15min。至少收集50mL的牛奶試樣，按照④繼續進行分析。
b.奶粉稱取10g 樣品（精確到0.1g）置于250mL 的燒杯。將50mL 已預熱到50℃的水每次少量地加入到奶粉中，用攪拌棒將其混合均勻。
如果奶粉不能完全地溶解，將燒杯在50℃的水浴中放置30min，仔細混勻。
將牛奶溶液冷卻至20℃后，用少量的水將其全部轉移到100mL 的容量瓶中，再用水稀釋至刻度。用濾紙過濾，或者在4000g 件下離心15min。至少收集50mL 的牛奶試樣，按照④繼續進行分析。
（3）免疫親和柱的準備
將一次性的50mL 注射器筒與親和柱的頂部相連，再將親和柱與真空系統連接起來。
（4）樣品的提取與純化
用移液管移取50mL 的試樣到50mL 的注射器筒中，使它們以2～3mL/min 穩定的流速通過親和柱，流速可以通過真空系統控制。
取走50mL 的注射器筒，并用干凈的10mL 注射器筒代替。然后用10mL 的水進行清洗，水的流速應該保持穩定。清洗后，讓親和柱的下部分完全干燥。
使親和柱與真空系統脫離后，將4mL 乙腈加入到10mL 的注射器筒中將親和柱上的黃曲霉毒素 M1 淋洗下來。所有4mL 乙腈通過親和柱的時間至少需要60s，流速可以通過注射器的柱塞來控制。將洗脫液收集于錐形試管中，然后用恒流的氮氣在30℃下將洗脫液吹干至體積為50～500μL（注意：如果蒸發至完全干燥，則會造成黃曲霉毒素M1的損失），體積數為 V，用水將其稀釋10倍至最終體積數為 V（即500～5000μL）。（注意：如果注入HPLC 的含有黃曲霉毒素M1的樣品中乙腈含量超過10％，色譜峰變寬。如果水的含量超過90％，則對色譜峰的形狀沒有影響。）
（5）高效液相色譜分析儀
a.泵 以恒定流速將洗脫液泵流通過 HPLC 柱。如果需要（根據所用色譜柱的型號），調整HPLC 洗脫液中乙腈/水的比例，以保證使黃曲霉毒素 M1 與其他成分的分離效果最佳。洗脫液的流速根據所用色譜柱的型號不同而有所差異。對于普通色譜柱（柱長約25cm、柱內徑約4.6mm）而言，流速在1mL/min 左右，效果最好；柱內徑約4.6mm 時，流速在0.5mL/min左右，效果最好。
為了確定最佳的色譜條件，可以先將樣品提取液（最好不含有黃曲霉毒素 M1）注入HPLC，然后再注入提取液與黃曲霉毒素 M1 標準溶液的混合液。
b.色譜性能 標準曲線的線性度和色譜系統的穩定性需要經常檢查，多次反復地注入固定量的黃曲霉毒素 M1標準溶液， 直至獲得穩定的峰面積和峰高。相鄰兩次峰面積和峰高的差異不得超過5％。
黃曲霉毒素 M1 的保留時間與溫度有關，所以對測定系統的漂移需要補償。過一段時間注入固定量的黃曲霉毒素 M1 標準溶液，這些標準溶液的測定結果可以根據漂移的情況進行校正。
c.黃曲霉毒素 M1 的標準曲線 根據 HPLC 進樣量，選擇適當的體積數為Ve，分別注入含有0.05ng，0.1ng，0.2ng和0.4ng的黃曲霉毒素M1標準溶液。繪制成峰面積或峰高對黃曲霉毒素 M1 質量數的標準曲線。
d.樣品洗脫液的色譜分析及進樣方案 通過進樣環將適量體積 Ve，洗脫液注入 HPLC。采用與標準溶液相同的色譜條件分離出洗脫液中的黃曲霉毒素M1。標準溶液和樣品洗脫液均按照規定的方案進樣。當檢測一系列連續樣品時，建議每隔5個樣品，加測一個黃曲霉毒素M1 標準溶液。
根據樣品洗脫液色譜圖中黃曲霉毒素 M1 的峰高或峰面積值，從標準曲線上查出注入的樣品洗脫液中所含有的黃曲霉毒素 M1 質量數（ng）。
如果樣品洗脫液的黃曲霉毒素 M1 的峰面積或峰高值高于標準溶解，用水定容稀釋樣品洗脫液后，重新進樣分析。
7、測定結果的計算與表示
（1）牛奶
a.計算 應用下式計算被測樣品中的黃曲霉毒素 M1 的含量m，單位為μg/L。
式中mA——根據樣品洗脫液的黃曲霉毒素M1的峰面積或峰高，從標準曲線上查得的黃曲霉毒素M1的質量數，ng；
Vi——注入樣品洗脫液的體積數，μL；
Vf——樣品洗脫液的最終體積數，μL；
V——通過親和柱被測樣品的體積數，mL
b.測定結果的表示 測定結果單位以 μg/L 表示，精確到小數點后三位。
（2）奶粉
a.計算 應用下式計算被測樣品中的黃曲霉毒素 M1 的含量 Ωp，單位為μg/L
式中，m 為50mL 樣液中所含有的奶粉質量數，g；mA，Vf，Vi的含義與（7）①a.中所定義的一樣。
這個公式僅僅適用于被測溶液沒有稀釋的情況，如果需要稀釋，則應該將稀釋倍數計算進去。
b.測定結果的表示 測定結果單位以 μg/kg 表示，精確到小數點后三位。