免疫親和柱凈化熒光法測定黃曲霉毒素M1

1、黃曲霉毒素 M₁ 簡述
黃曲霉毒素 M₁ 是動物攝入黃曲霉毒素B₁后在體內經羥基化代謝的產物,一部分從尿和乳汁排出,一部分存在于動物的可食部分,如乳、肝、蛋類、腎、血和肌肉中,其中以乳最為常見,且乳和乳制品中的黃曲霉毒素 M₁在生產和貯藏期間相對穩定,不被巴氏消毒破壞。用含有黃曲霉毒素 B₁100μg/kg 的飼料喂牛,牛乳中含有黃曲霉毒素 M₁ 約為1μg/kg。黃曲霉毒素 M₁ 的毒性和致癌性與黃曲霉毒素 B₁ 的基本相似。由于牛乳及其制品是人類、特別是嬰兒的主要食品,因此各國對其限量的要求十分嚴格,一些國家規定牛奶及奶制品中黃曲霉毒素 M₁ 的含量不得超過0.5μg/kg,而歐盟的規定更加嚴格為0.05μg/kg。下面介紹的是免疫親和柱凈化熒光計測定測定牛奶和奶粉中黃曲霉毒素 M₁ 含量。

2、免疫親和柱凈化熒光計快速測定法
(1)測定原理

試樣經過離心、脫脂、過濾后,濾液經過鍵合有黃曲霉毒素 M₁ 特殊抗體的免疫親和柱凈化,此抗體對黃曲霉毒素 M₁ 具有專一識別能力,黃曲霉毒素 M₁ 鍵合在分離柱中的抗體上。用甲醇/水(10+90)將免疫親和柱上雜質除去,以甲醇/水(80+20)通過分離柱洗脫,加入溴溶液衍生,以提高測定靈敏度。衍生化后的洗脫液于熒光光度計中測定黃曲霉毒素 M₁。

(2)儀器設備與試劑

甲醇(CH₃OH):液相色譜級純。

氯化鈉(NaCl)。

溴儲備液(0.01%):稱取適量溴,溶于水,配成0.01%的儲備液,避光保存。

溴水使用液(0.002%):取10mL 0.01%的溴溶液加入40mL 水混勻,于棕色瓶中保存備用。需現用現配。

硫酸溶液(0.05mol/L):取2.8mL 濃硫酸,緩慢加入適量水中,冷卻后定容至1000mL。

熒光光度計校準溶液:稱取0.340g 硫酸奎寧(C₂₀H₂₄N₂O₂·H₂SO₄·2H₂O)用0.05mol/L 硫酸溶液稀釋至100mL,此溶液相當于2ng/g 黃曲霉毒素M₁標準溶液,0.05mol/L硫酸溶液相當于0ng/g 黃曲霉毒素M₁。

真菌毒素專用熒光分析儀。

離心機(離心力大于2000g)。

玻璃纖維濾紙(直徑11cm,孔徑1.5m)。

免疫親和柱:內含單株抗體對黃曲霉毒素M₁具有專一性。

空氣壓力泵。

玻璃試管(12mm×75mm,無熒光特性)。

(3)分析步驟

①樣品提取 

量取50mL 牛奶樣品,加入1.0g 氯化鈉,在離心機上以2000g 離心10min,小心仔細地將用于牛奶分析的有效部分(低層)移取,不要擾動頂部脂肪層(可以這樣進行操作:用注射器針頭將塑料離心管的底部戳一個洞,讓底層分離下來),將脫脂的牛奶以玻璃纖維濾紙過濾。

②凈化 

將免疫親和柱連接于10mL 玻璃針筒下。準確移取10.0mL 上述澄清液注入玻璃針筒中,將空氣壓力泵與針筒連接,調節壓力使溶液以約6mL/min 流速緩慢通過免疫親和柱,直至2～3mL 空氣通過柱體。以10mL 甲醇/水(10+90)清洗柱子2次,棄去全部流出液,并使2～3mL 空氣通過柱體。準確加入1.0mL 甲醇/水(80+20)洗脫,流速為1～2mL/min,收集洗脫液于玻璃試管中,供檢測用。

③測定

熒光光度計校準在激發波長360nm,發射波長450nm 條件下,以0.05mol/L 硫酸溶液為空白,調節熒光光度計的熒光強度值讀數為0.0;以校準溶液調節熒光光度計的熒光強度值讀數為2.0。

樣液測定取上述洗脫液加入1.0mL 0.02%溴溶液,于熒光光度計中測定黃曲霉毒素M₁含量。

④結果計算  熒光光度計測定結果按下列公式計算:

式中X——試樣中黃曲霉毒素M₁含量,ng/g;
      c——熒光光度計中讀取的樣液中黃曲霉毒素M₁的濃度,ng/mL;

      V——樣液最終定容體積,mL;
      m——最終樣液所代表的試樣量,g。
(注:計算結果需扣除空白值。)