免疫親和柱熒光分光光度法檢測分析黃曲霉毒素

黃曲霉毒素免疫親和柱-高效液相色譜法比傳統的 HPLC 法更加安全、可靠、靈敏度和準確度高。它采用單克隆抗體免疫技術可以特效性地將黃曲霉毒素或其他真菌毒素分離出來,分離效率和回收率高。

分析原理  

試樣中的黃曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取,提取液經過過濾、稀釋后,用免疫親和柱凈化,以甲醇將親和柱上的黃曲霉毒素淋洗下來,在淋洗液中加入溴溶液衍生,以提高測定靈敏度,然后用熒光分光光度計進行定量。也可以將甲醇-黃曲霉毒素淋洗液的一部分注入 HPLC 中,對黃曲霉毒素 B₁,B₂,G₁,G₂ 分別進行定量分析。免疫親和柱是用大劑量的黃曲霉毒素單克隆抗體固化在水不溶性的載體上,然后裝柱而成。該方法的測定范圍0～300μg/kg。

分析儀器及試劑
4系列真菌毒素專用熒光分析儀。

黃曲霉毒素免疫親和柱。

0.03%的溴溶液。

熒光分析儀校準溶液:稱取3.40g 二水硫酸奎寧,用0.05mol/L 的稀硫酸稀釋至100mL。

氯化鈉(分析純)。

甲醇(色譜級)。

二次蒸餾水。

1.5μm的玻璃纖維濾紙。

測定步驟

①試驗準備

a.標定熒光計。

b.配制0.003%溴衍生溶液(一天配制一次):取5mL 0.03%的溴溶液,加入45mL 的純水。

c.配制甲醇:水(60:40體積比)溶液。

d.試劑空白試驗(1mL甲醇+1mL 0.003%溴衍生液置于測試管中),熒光計讀數應為0。

e.純水空白試驗(2mL 純水置于測試管中),熒光計讀數應為0。

②樣品提取

a.稱取25g 磨細的樣品(液體樣品直接稱取),5g 氯化鈉,置于攪拌杯中。

b.加入125mL 甲醇:水(60+40)溶液。

c.蓋上攪拌杯的蓋子,高速攪拌1min。

d.取下蓋子,將提取物倒入折疊式濾紙上,濾液收集于干凈的容器中。

③提取物的稀釋

a.移取20mL 上步的濾液,置于干凈的容器中。

b.用20mL 純水將濾液稀釋,混勻。

c.將上步稀釋液通過玻璃纖維濾紙,濾液收集于玻璃注射器筒中,量取10mL ④親和柱色譜操作。

a.將上步10mL 濾液(10mL 相當于1.0g 的樣品),以1～2滴/秒的流速全部通過AflaTest-P親和柱,直至空氣進入到親和柱中。

b.將10mL 純水以2滴/秒的流速通過親和柱。

c.將10mL純水以2滴/秒的流速再次通過親和柱,直至空氣進入到親和柱中。

d.用1.0mL HPLC 級的甲醇以1～2滴/秒的流速淋洗親和柱,將所有樣品淋洗液(1mL)收集于玻璃測試管中。將1.0mL 0.003%溴衍生溶液加到測試管的淋洗液中,混勻。

⑤用熒光光度計測定將制備好樣液的測試管置于已標定好了的熒光計中。60s 后讀數,測定結果為 B₁+B₂+G₁+G₂ 總量。

⑥用 HPLC 進行測定

a.從第四步1mL 的甲醇-黃曲霉毒素洗脫液取100μL,直接注入 HPLC 中,即可得到如圖所示的譜圖,然后可分別測定出黃曲霉毒素 B₁,B₂,G₁,G₂ 的含量。

b.HPLC 的工作條件

柱:反相 C18(Waters Nova pak C18,5mm×100 mm,4μm cartridge,Whatman Partisphere RTF C18,4.6mm×150mm或者 Merck C18 column,5mm×12.5cm,5μm)。

流動相:甲醇:水(45:55)脫氣。

流速:0.8 mL/min。
熒光檢測器:激發波長360nm,發射波長440nm。

后置柱衍生液:0.05%碘溶液。
流速:0.2mL/min。
反應溫度:70℃(恒溫箱的溫度)。
反應時間:1min。