蛋白來源:RAW264.7 總蛋白
蛋白名稱:一些轉錄因子
蛋白分子量:40~70 KD
WB 用膜類型、孔徑:0.45 NC
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流 400 mA
轉膜時間:60~90 min
PS. 其實吧,以我的經驗來看,除非目的蛋白特別小,或者特別大,不然轉膜時間真的不是那么重要, 曾經因為失誤,轉了 15 min 就拆下來了,但從麗春紅染色來看,跟平常實驗也沒有太大的區別。
蛋白來源:內皮細胞 總蛋白
蛋白名稱:occludin & AKT
蛋白分子量:65 KD & 56 KD
WB 用膜類型、孔徑:0.45 PVDF
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒壓 100 V
轉膜時間:60~70 min
設備名字是「Bio-Rad mini」。
蛋白來源:腫瘤手術標本
蛋白名稱:轉錄因子
蛋白分子量:33 KDa
WB 用膜類型、孔徑:PVDF 膜
轉膜方式(恒壓、恒流):350 mA 恒流
轉膜時間:150 min
轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
說明:相同條件曾用于數個 30-70 KDa 的蛋白,都能成功轉上,不過沒有試縮短時間效果如何; 實驗時沒為轉膜條件苦惱,倒是電泳時膠的濃度及時間根據不同分子量而有區別。
蛋白來源:成纖維細胞
蛋白名稱:smad3
蛋白分子量:54 KDa
WB 用膜類型、孔徑:PVDF 膜
轉膜方式(恒壓、恒流):350 mA 恒流
轉膜時間:150 min
轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
蛋白來源:腫瘤細胞
蛋白名稱:磷酸化蛋白
蛋白分子量:10-200 KDa
WB 用膜類型、孔徑:millipore PVDF 膜 0.45 um
轉膜方式(恒壓、恒流):120 v 恒壓
轉膜時間:120 min
轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
建議:轉膜緩沖液只用 2 次,基本都轉上,5%BSA 封閉,減少背景。
蛋白來源:Hepg2
蛋白名稱:EGFR
蛋白分子量:170kd
WB 用膜類型、孔徑:pvdf 0.45
轉膜方式(恒壓、恒流):24V
轉膜時間:2 個半小時
轉膜設備:伯樂半干轉
蛋白來源:肝癌細胞
蛋白名稱:HIF-1α
蛋白分子量:120 kD
WB 用膜類型、孔徑:NC 膜
轉膜方式(恒壓):80 伏,濕轉
轉膜時間:150 分鐘
設備:「Bio-Rad mini」
建 議:濕轉,轉膜液特別重要,否則會導致電壓或者電流不穩影響轉膜條帶。轉膜均現配先用,不重復利用。轉膜時間一般是 150 分鐘,80 伏恒壓。經李春紅染 色,靠近蛋白膠的一側膜上蛋白染色深,膜另外一面染色淺,說明蛋白未轉過。該濕轉條件自己做過的蛋白分子量范圍:170-36 kD。
蛋白來源:肺臟
蛋白名稱:ICAM-1
蛋白分子量:85~110 KD
WB 用膜類型、孔徑:0.22NC
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流 300 mA
轉膜時間:120 min
設備名字 Bio-Rad mini
一抗用的 santa cruz 1 mL 包裝的。 比例調整到 1:800 做出很好的條帶。 效價會一直降低的。去年做的這個指標,今年夏天做就不行了。
蛋白來源:人腫瘤細胞
蛋白名稱:磷酸化蛋白
蛋白分子量:30-60 KDa
WB 用膜類型、孔徑:pall NC 膜 0.45 um
轉膜方式(恒壓、恒流):恒流 0.85-1 mA/平方厘米膜
轉膜時間:60-90 min
轉膜設備: 北京六一 半干轉
建議:轉膜緩沖液用新鮮配制的,可先配成 2 倍的母液,轉膜液的多少會影響電轉的效率,一般將吸水紙潤濕即可,不要和膜一起浸泡,這樣效果很好。
蛋白來源:人肝癌腫瘤細胞
蛋白名稱:notch
蛋白分子量:60-120 KDa
WB 用膜類型、孔徑:pall NC 膜 0.45 um
轉膜方式(恒壓、恒流):恒流 0.3 A
轉膜時間:-20 度冰柜 120 min
轉膜設備: 濕轉 Bio-Rad
建議:轉膜緩沖液用新鮮配制的,可先配成 10 倍或 5 倍的母液,保持低溫是轉膜效果的一個保證,這樣效果很好。
蛋白來源:肺臟、肝臟等。
蛋白名稱:actin
蛋白分子量:43 kD
WB 用膜類型、孔徑:NC 膜 PALL 0.22 um
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流 200 mA
轉膜時間:45~60 min
設備名字 Bio-Rad mini
用的 santa cruz 分裝和整裝的都可以。效價一般 1:1000-1:3000 左右,可穩定較長一段時間。
蛋白來源:細菌蛋白
蛋白名稱:全部的可溶性蛋白
蛋白分子量:11-170 KD
WB 用膜類型、孔徑:0.45 NC
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流 300 mA
轉膜時間:80 min
蛋白來源:骨肉瘤 CELL LINE
蛋白名稱:Beta actin
蛋白分子量:42 kDa
WB 用膜類型、孔徑:Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉,恒壓 22 v
轉膜時間:90 min
轉膜設備:X-cell Sure Lock Mini-cell (Invitrogen)
建議改進方向:轉膜過程冰水浴,保持低溫,Transfer Buffer 重復使用。
蛋白來源:腎瘤細胞
蛋白分子量:39 kDa
WB 用膜類型、孔徑:Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒壓 100 v
轉膜時間:50 min
蛋白來源:pichia 分泌表達
蛋白名稱:細胞因子等
蛋白分子量:17 到 30 kDa
WB 用膜類型、孔徑:millipore PVDF 0.45 um
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒壓:100 V
轉膜時間:60 min
這個條件除了 100 KDa 的預染 maker 轉的不好,剩下的條帶都非常清晰。正向前面 ycwzq 說的,感覺時間不是很重要,只要蛋白別太小或太大,在一個比較寬的時間和電壓范圍都能轉上。當然這些還有一個重要的影響因素就是所用的蛋白轉印緩沖液。
蛋白來源:小鼠前列腺癌細胞
蛋白名稱:P53 P21 RAD51 GAPDH
蛋白分子量:53 KDa、21 KDa、37 KDa、36 KDa
WB 用膜類型、孔徑:PVDF 膜 0.45
轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓 110 v
轉膜時間:60 min
轉膜設備: 濕轉 Bio-Rad mini
蛋白來源: 來自 MDCK 增殖的流感病毒裂解物
蛋白名稱:PB1
蛋白分子量: 96 kd(注意,10% SDS-PAGE,冰上電泳。用預染 marker 觀察 100kd 的條帶跑到膠的正中間位置時,才開始轉膜,否則轉膜效率降低)
WB 用膜類型、孔徑: NC 膜, 0.45
轉膜方式(恒壓、恒流):恒壓,100V
轉膜時間: 2 hours
轉膜設備: BIO-rad 轉膜設備。其間,準備一個冰盒,將電泳槽半埋到冰里。
轉膜液的配制:(如甲醇的比例和是否加 SDS 以及多大質量濃度等): 2.9 g 甘氨酸,5.8 g tris,0.37 g SDS,200 ml 甲醇。
蛋白來源: 軟骨細胞
蛋白名稱:b-actin
蛋白分子量: 43 kd
WB 用膜類型、孔徑: PVDF 膜, 0.45
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉,恒流,350 mA
轉膜時間: 85 min
轉膜設備: BIO-rad 轉膜設備。其間,準備一個冰盒,將電泳槽半埋到冰里。
轉膜液的配制:(2.92 g 甘氨酸,5.8 g tris,0.375 g SDS,200 ml 甲醇,用雙蒸水定容到 1 L)
蛋白來源:HepG2 細胞
蛋白名稱:Akt 及 P-Akt
蛋白分子量:55KDa/56KD
WB 用膜類型、孔徑:PVDF 膜 0.45 孔徑
轉膜方式(恒壓、恒流):100V 恒壓
轉膜時間:75 min
轉膜設備: 濕轉 Bio-Rad
蛋白來源:大鼠
蛋白名稱:Bactin(42 KDa)
WB 用膜類型、孔徑:PVDF(0.45)膜
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流 150 mA
轉膜時間:100 min
轉膜設備: 北京六一
蛋白來源: 大鼠大腦皮質
蛋白名稱:b-actin
蛋白分子量: 43 kd
WB 用膜類型、孔徑: PVDF 膜, 0.45
轉膜方式(恒壓、恒流):半干轉,恒流,2 mA/cm2
轉膜時間: 8-55 min
轉膜設備: BIO-rad 轉膜設備。
轉膜液的配制:(2.92 g 甘氨酸,5.8 g tris,0.375 gSDS,200 ml 甲醇,用雙蒸水定容到 1 L)