對于Western Blotting實驗而言,樣品處理是關鍵步驟之一,獲得的蛋白樣品必須均質、可溶,并解離成單個多肽亞基,且盡量減少相互間的聚集,使其最終僅依賴本身的分子量大小進行分離。
當目標蛋白的含量很低時,需要選取目標蛋白含量較高的組織或細胞器(如核抽提物),或者通過免疫沉淀等方式進行富集。通常樣品有重組蛋白、細胞和組織等。
1. 樣品收集
1)培養的細胞
貼壁和懸浮細胞收集方式不同,細胞裂解液種類各異,推薦含SDS的凝膠加樣緩沖液裂解,煮沸即可。
2)動物組織
與細胞不同,組織塊由于體積較大,須預先經破碎勻漿處理。
2.樣品定量
樣品電泳前需測定蛋白濃度,以便保證上樣量一致,有利于后續定量或半定量分析。常用的蛋白質濃度測定方法有好多種,其靈敏度和所需時間不同,且不同的方法會受不同干擾物質的影響,實驗者可根據樣品制備方法(裂解液成分、去垢劑和還原劑種類等)自行選擇。
幾種蛋白質濃度測定方法比較
注意事項:
a. 應盡量避免引入影響后續定量的雜蛋白(如細胞培養液、蛋白酶抑制劑等)及其他干擾物質;
b. 樣品濃度應適中,1×SDS凝膠加樣緩沖液建議用量:貼壁細胞按10 cm2培養皿/0.1 ml,懸浮細胞按5×106細胞/0.1 ml比例加入;
c. SDS對蛋白質變性和電泳分離至關重要,濃度應控制在2-10% 之間,并根據具體需要調整;
d. 制備好的樣品可以在-20℃ 保存,但時間不宜過長,并避免反復凍融,否則蛋白會發生降解;
e. 內參對實驗結果至關重要,應選擇合適的內參。