免疫雙擴散檢測抗GFP血清抗體

實驗概要

本實驗利用免疫雙擴散檢測了抗GFP血清抗體。

實驗原理

在溶液中的可溶性多價抗原與血清抗體相遇，當兩者的比例適當時可以形成一種網狀的不溶性的大分子復合物，這叫作免疫沉淀反應。當這樣的抗原和相應的抗體在含有電解質的瓊脂凝膠中相對擴散時，在抗原與抗體的比例適當處會形成可見的沉淀線，這叫免疫雙擴散實驗，是免疫沉淀反應的一種。免疫雙擴散常用于動物免疫效果的檢測和血清抗體效價的測定。本實驗使用的粗抗原是大腸桿菌表達的GFP的抽提物，抗體是GFP免疫兔子后得到的抗血清。

主要試劑

1. 磷酸鹽緩沖液（PBS），pH 7.4
2. 1.5%瓊脂，PBS配置
3. 兔抗GFP血清
4. GFP粗提物

主要設備

1. 微波爐
2. 恒溫培養箱
3. 載玻片
4. 自制打孔器
5. 小塑料盒
6. 針頭、牙簽
7. “槍”、“槍頭”

實驗步驟

1. 1.5%瓊脂的配制：pH 7.4的PBS 100mL中加1.5克瓊脂，微波爐中小功率加熱，使瓊脂完全溶化。
2. 取干凈的載玻片，平放于實驗臺（臺面要水平），將融化的瓊脂趁熱加在載玻片上（約加4mL），使瓊脂鋪滿整個玻片的表面。令其在室溫下冷卻凝固。
3. 將載玻片放在畫好的打孔式樣的樣板上，用自制打孔器（內徑2-3毫米）在瓊脂上照樣板打孔，做兩朵“花”。用針頭小心地將打好的孔中的瓊脂挑出，當心不要碰傷了孔周圍的瓊脂。打好孔后，把凝膠的右下角切掉一小塊，作為標記。
4. GFP抗原的稀釋：用上次實驗得到的GFP粗提物的飽和硫酸銨沉淀，加100mL的PBS使溶解，此為抗原的原液。取出原液15mL，在一小塊封口膜上用PBS做系列的倍比稀釋，直到稀釋為1：16。
5. 在左邊一朵花的中央孔中加約15mL的免疫后兔血清，周圍孔加不同稀釋度的GFP粗提物。右邊的一朵花除中央孔中加免疫前的兔血清外其余的與左邊的相同。
6. 在小塑料盒中鋪一塊濾紙，加少量水將濾紙浸濕，上面放兩根牙簽，將加好樣的載玻片放在牙簽上，蓋好盒蓋，放37℃溫箱中過夜。
7. 實驗結果的觀察
將載玻片從塑料盒中取出，在散射光的背景下（載玻片后方約15厘米處用手或深色物擋住）觀察，或在特殊的裝置上觀察，在左側的抗體孔與適當稀釋的抗原孔之間可見白色的沉淀線，而右側的對照則無。如果將載玻片放在紫光燈下觀察，沉淀線會發出綠色熒光，這說明抗原-抗體復合物中含有GFP。

注意事項

1. 使用瓊脂鋪玻片時，注意勿使瓊脂流出玻片之外。

2. 加樣時將每孔加滿即可，注意不要使溢出孔外。